有机酸未解离形式基于[GAR+]细胞在酿酒酵母中的出现改变糖代谢

《Yeast》：Sugar Metabolisms Altered By Undissociated Forms of Organic Acids Based on the Emergence of [GAR+] Cells in Saccharomyces cerevisiae

　　

葡萄糖抑制系统是微生物通过葡萄糖同化作用有效获取能量的机制。在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中，被称为类朊病毒蛋白的[GAR⁺]涉及葡萄糖抑制的旁路途径。已有报道，乳酸和乙酸促进了[GAR⁺]细胞的产生。在此，研究人员研究了丙酮酸（既为糖酵解的终产物，又是有机酸合成的前体）对[GAR⁺]产生的促进作用，并将丙酮酸的结果与乳酸或乙酸的结果进行了比较。丙酮酸以及其他有机酸在所有测试的酿酒酵母菌株中均促进了[GAR⁺]的产生，但不同菌株间有机酸诱导[GAR⁺]产生的模式有所差异。当pH值高于每种有机酸的pKa值时，所有三种有机酸诱导[GAR⁺]的能力均减弱，表明有机酸的未解离形式可能促进了[GAR⁺]的出现。

**研究背景与问题**：在异养微生物中，细胞能量主要通过葡萄糖等有机物的分解代谢获取。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）在葡萄糖丰富条件下，会抑制其他碳源利用途径，这一系统称为葡萄糖抑制。类朊病毒蛋白[GAR⁺]可表观遗传地使酵母细胞绕过葡萄糖抑制，从而在葡萄糖存在下利用多种碳源。自发[GAR⁺]出现频率极低（约10^-4至10^-5）。先前研究发现乳酸和乙酸可促进[GAR⁺]细胞出现，且乳酸是清酒醪中最丰富的有机酸，丙酮酸是第三大有机酸。因此，研究人员旨在系统比较乳酸、乙酸和丙酮酸对[GAR⁺]出现的促进作用，并探究环境pH与有机酸pKa值对诱导的影响。

**研究内容与结论**：该研究使用5株酿酒酵母（包括实验室菌株S2888C、X2180，清酒酿造菌株701、901，以及传统生酛法分离菌株U44），通过GGM选择性培养基评估有机酸对[GAR⁺]出现频率的影响。结果表明：10 mM的乙酸、乳酸和丙酮酸均能显著促进所有测试菌株中[GAR⁺]的出现（频率接近1细胞/总细胞）；在低浓度（0.625或1.25 mM）下，乙酸对菌株X2180和701的促进能力高于乳酸和丙酮酸，而菌株U44中丙酮酸活性相对更高；环境pH高于有机酸pKa值时，促进能力显著下降，且菌株X2180和701的[GAR⁺]出现率与pKa值呈正相关（R²≈0.97），而菌株U44呈负相关（R²=0.998）。此外，从含乳酸的GGM培养基中分离的克隆仍保持[GAR⁺]表型，但连续暴露于有机酸是维持该表型所必需的。该研究首次报道丙酮酸对[GAR⁺]的促进作用，并揭示未解离形式有机酸是关键诱导因素。

**论文发表**：该论文发表在《Yeast》期刊。

**主要关键技术方法**（不超过250字）：
1. **[GAR⁺]自发出现检测**：将处于对数生长期的酵母细胞涂布于GGM（甘油/葡糖胺）琼脂平板，30°C培养5天后计数菌落，并以YPG平板上的活菌数归一化。
2. **有机酸诱导[GAR⁺]出现检测**：将细胞涂布于含10 mM乙酸、乳酸或丙酮酸的GGM琼脂，30°C培养48小时后计数。
3. **pH效应实验**：制备含10 mM有机酸且pH值调至4.0-8.0的GGM琼脂，评估[GAR⁺]出现率。
4. **生长斑点实验**：将酵母细胞系列稀释后点样于含5 mM有机酸的YPG琼脂，验证有机酸对细胞生长的支持作用。
5. **[GAR⁺]表型保留实验**：从含5 mM乳酸的GGM上随机挑取11个克隆，重新点样于GGM琼脂，确认其是否仍具[GAR⁺]表型。
（样本来源：实验室和清酒酿造菌株来自日本国家酿造研究所等。）

**研究结果**（保留小标题，简要说明通过什么研究得出什么结论）：
- **3.1 酿酒酵母菌株中[GAR⁺]细胞的自发产生**：通过自发出现检测发现，实验室菌株和清酒酿造菌株（除U44外）的[GAR⁺]自发出现率为10^-5至10^-4，而菌株U44显著更高（约10^-1）。
- **3.2 不同有机酸对[GAR⁺]细胞的诱导**：在10 mM浓度下，乙酸、乳酸和丙酮酸均使所有测试菌株的[GAR⁺]出现率接近1，且培养时间从5天缩短至48小时。
- **3.3 有机酸促进[GAR⁺]出现的剂量依赖性**：通过剂量依赖性检测发现，菌株X2180和701中乙酸在低浓度（≤1.25 mM）下促进能力显著高于乳酸和丙酮酸；菌株U44中丙酮酸活性相对较高；生长实验排除有机酸仅通过促进细胞生长导致菌落增加的可能，且斑点实验证实乳酸确实诱导了[gar^-]向[GAR⁺]的转化。
- **3.3.1 环境pH对有机酸促进[GAR⁺]出现的影响**：pH<7时促进活性高，pH>6.5时显著下降，表明有机酸的解离状态至关重要。
- **3.4 [GAR⁺]促进能力与有机酸pKa的相关性**：通过将1.25 mM有机酸下的[GAR⁺]出现率与其pKa值作图发现，菌株X2180和701中呈正相关（R²≈0.97），而菌株U44呈负相关（R²=0.998），暗示不同菌株的机制可能存在差异。

**讨论与结论**：
讨论部分指出，乳酸和乙酸被认为是酿酒酵母与细菌（包括乳酸菌LAB和醋酸菌）之间的跨界通讯工具。本研究发现丙酮酸同样具有促进[GAR⁺]出现的能力，且所有测试菌株在高浓度（10 mM）下响应一致，表明有机酸响应机制在酿酒酵母中保守。未解离形式有机酸可通过被动运输进入细胞，导致细胞内酸化，可能影响质膜H⁺-ATP酶Pma1的功能或构象，进而促进[GAR⁺]表型的出现。菌株U44显示负相关，推测其可能具有独特的细胞内有机酸或pH感应机制，需通过全基因组分析进一步阐明。

**研究结论（翻译）**：
本实验在包括实验室菌株和清酒酿造菌株在内的多种酿酒酵母菌株中，检验了有机酸在不同条件下促进[GAR⁺]出现的能力。研究人员假设，有机酸促进[GAR⁺]出现的机制在菌株间基本保守。关于有机酸诱导[GAR⁺]出现的许多细节仍有待阐明。因此，有必要确定除乙酸、乳酸和丙酮酸外的其他有机酸是否也能促进[GAR⁺]出现。有机酸作为清酒酸味的主要决定因素，被认为在发酵过程中抑制有害细菌的生长。本研究的新发现表明，这些酸通过提高清酒醪中[GAR⁺]酵母细胞的比例，也影响乙醇生产。从商业应用角度应考虑此类有机酸在提高酿造效率中的作用（Saerens et al. 2010）。