综述：裂殖酵母线粒体代谢与稳态研究方法

《Yeast》：Methods to Study Mitochondrial Metabolism and Homeostasis in Fission Yeast

　　

裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）是研究线粒体的有力模型。本文系统阐述了用于解析线粒体功能与稳态的活体与体外研究方法，涵盖线粒体代谢、生物能量学及氧化还原平衡的检测方案，详细描述了ATP、H2O2、NAD(P)H的活体测量用生物传感器，同时介绍了线粒体形态与呼吸超复合物的分析工具。线粒体是有氧生长条件下真核细胞不可或缺的具双层膜细胞器，作为能量产生的核心枢纽，通过氧化磷酸化生成ATP以支持细胞生长与增殖。除核心代谢功能外，线粒体还参与铁硫簇生物合成、血红素合成、氧化还原稳态维持，以及氨基酸、脂质、核苷酸生物合成所需代谢中间产物的生成，因此既是生物能量细胞器，也是细胞代谢与信号整合的关键节点。鉴于线粒体的多面功能，其活性必须与细胞需求紧密协调、严格调控。线粒体代谢或稳态的扰动会对细胞生理产生深远影响，涉及生长、应激响应、衰老与存活，因此解析不同环境与营养条件下的线粒体功能调控机制是细胞生物学的核心科学问题。裂殖酵母是芽殖酵母之外研究线粒体代谢与稳态的补充模型体系，具备多重优势：拥有完善的注释数据库Pombase，存在商业化基因缺失文库，且其线粒体生理特征比酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）更接近人类细胞。研究人员将简要总结裂殖酵母及其他真核生物中用于研究线粒体代谢（第一部分）与线粒体稳态（第二部分）的活体与体外策略，并在各部分开篇阐明裂殖酵母作为线粒体研究替代模型的核心特征。

1 线粒体代谢监测

葡萄糖的代谢去向主要包括三条途径：经糖酵解氧化为丙酮酸后通过发酵途径还原生成乙醇；糖酵解来源的丙酮酸进入线粒体，氧化为乙酰辅酶A后经三羧酸（TCA）循环与氧化磷酸化进一步代谢；或在葡萄糖-6-磷酸节点分流进入磷酸戊糖途径。发酵过程中，糖酵解生成的NADH被再氧化，每分子葡萄糖仅产2分子ATP；而TCA循环既为氨基酸、脂质、核苷酸合成提供中间产物，也生成NADH与FADH₂形式的还原当量，输入电子传递链（ETC）。ETC利用这些还原当量在内 mitochondrial 膜建立质子梯度，再由ATP合酶转化为ATP，每分子葡萄糖最多可生成17–18分子ATP。多数酵母不存在呼吸复合体I，仅含有无质子泵活性的NADH脱氢酶。丙酮酸流向发酵还是有氧呼吸是核心代谢决策，受环境条件调控：包括裂殖酵母与酿酒酵母在内的多种酵母在高糖好氧条件下倾向于发酵代谢，有氧呼吸被抑制，即克拉布特里效应（Crabtree effect）；而在营养限制条件下，代谢平衡向呼吸偏移以最大化葡萄糖的能量产出。不同酵母物种对有氧呼吸的依赖程度存在显著差异： petite阳性酵母（如酿酒酵母）可在氧化磷酸化缺失甚至线粒体DNA缺失的情况下增殖，其通过分支TCA循环供应关键代谢中间产物、激活乙醛酸循环实现C₂单位净合成TCA中间产物，从而绕过有氧呼吸需求；与之相对，petite阴性酵母（如裂殖酵母）更接近哺乳动物细胞，无法在无有氧呼吸的情况下存活。即使在发酵条件下，裂殖酵母的有氧呼吸也不会被完全抑制，部分功能的TCA循环与氧化磷酸化可持续合成细胞增殖必需的氨基酸。这种对有氧呼吸的依赖性使裂殖酵母成为解析线粒体代谢、动态与质量控制的理想模型。

1.1 监测代谢的活体实验方法

本部分介绍用于解析酵母代谢多维特征的系列工具，包括能量状态检测（ATP与NAD(P)H/NAD(P)⁺生物传感器）、耗氧量测定、线粒体膜电位检测与氧化还原状态分析，相关技术路线见图1A。

1.1.1 能量状态

明确葡萄糖流向发酵或有氧呼吸的路径，以及通路对不同环境或营养条件的响应，需要能够精准监测细胞代谢状态的实验手段。

1.1.1.1 ATP生物传感器

QUEEN是一种基因编码荧光ATP传感器，基于插入细菌FoF₁-ATP合酶ε亚基的环形排列增强型绿色荧光蛋白（cpEGFP）构建，属于比率型生物传感器，可实现活细胞内ATP水平的绝对定量，用于解析不同遗传背景或营养条件下的葡萄糖代谢模式。该传感器已成功通过整合型质粒在裂殖酵母中表达，由强组成型启动子tif51驱动。QUEEN不仅能定量基础ATP水平，还可通过特异性代谢抑制剂区分ATP的糖酵解来源与线粒体来源：不可磷酸化的葡萄糖类似物2-脱氧葡萄糖阻断糖酵解，反映细胞ATP储备；线粒体复合体III抑制剂抗霉素A选择性抑制有氧呼吸。该传感器通过410 nm与480 nm两个激发波长的荧光比值实现ATP水平与来源的定量，可在单细胞水平通过荧光显微镜检测，也可通过酶标仪进行批量检测。目前QUEEN已在裂殖酵母细胞质中成功表达，但尚未证实其在线粒体中的适用性。

1.1.1.2 氧化还原状态：NAD(P)H生物传感器

细胞氧化还原状态是代谢活性与通路利用的核心指标。基因编码荧光生物传感器Peredox及其衍生物通过荧光强度变化报告NADH/NAD⁺比值，反映糖酵解与呼吸代谢的平衡；NAPstar系列传感器则专门用于监测NADPH水平，可用于解析合成代谢与磷酸戊糖途径活性。这两类传感器尚未在裂殖酵母中实现表达，也未被证实可在线粒体基质中发挥功能，是目前本综述中唯一尚未适配裂殖酵母的生物传感器技术。

1.1.2 耗氧量——克拉克电极与Seahorse分析仪

酵母耗氧率直接反映线粒体ETC活性，是不同营养条件或遗传背景下呼吸代谢的直接读数。呼吸活性可通过氧电极（如克拉克型电极、Oroboros O2k平台）检测，后者基于克拉克技术实现高分辨率呼吸测量，还可联用ATP潜能或活性氧（ROS）生成检测，计算得到的耗氧率可归一化至细胞数量或生物量，实现呼吸活性的定量比较。Seahorse分析仪等高通量呼吸分析平台通过检测微室中氧浓度变化，实现活细胞耗氧的实时监测，可获得基础呼吸水平及代谢扰动下的呼吸响应。两类方法均可结合药理学工具解析呼吸功能：抗霉素A阻断电子传递链电子流，完全抑制耗氧；质子载体FCCP作为解偶联剂，消散线粒体内膜质子梯度，解除质子动力势对ETC的反向压力，使电子通量与耗氧达到最大值，独立于ATP合成，从而揭示细胞的最大呼吸能力。

1.1.3 线粒体膜电位

线粒体膜电位（ΔΨm）是反映ETC活性的核心参数。酵母中ΔΨm可通过电位依赖性荧光染料评估，常用染料包括MitoTracker CMXRos与3,3′-二己基恶碳花青碘化物（DiOC₆）。MitoTracker Red CMXRos是细胞通透性的罗丹明衍生物，含巯基反应性氯甲基官能团，初始线粒体富集依赖膜电位，随后与线粒体蛋白巯基共价结合，实现荧光信号的稳定保留。呼吸活性升高通常伴随膜极化增强与染料富集增加，呼吸活性降低则染色减弱。DiOC₆是亲脂性阳离子碳花青染料，可被动跨膜分布并优先在线粒体积累，其荧光强度变化可反映线粒体极化状态，但需注意该染料也可标记内质网等其他内膜系统，需优化浓度并设置对照。

1.1.4 氧化还原状态

线粒体是胞内ROS的主要来源，主要源于ETC电子泄漏导致氧的部分还原生成超氧化物，进而转化为过氧化氢（H₂O₂）。H₂O₂可扩散至其他细胞区室，兼具信号分子功能与潜在损伤风险，主要由血红素类过氧化氢酶与硫醇类过氧化物酶（包括过氧化物氧还蛋白与谷胱甘肽过氧化物酶）清除。胞内H₂O₂水平可通过基因编码氧化还原生物传感器检测，常用包括与过氧化物氧还蛋白融合的roGFP2衍生物与HyPer家族传感器：原始HyPer源自大肠杆菌氧化还原敏感性调控转录因子OxyR，两类传感器均通过比率型荧光变化反映氧化状态，可检测稳态H₂O₂水平与细胞清除能力，适用于荧光显微镜、酶标仪或流式细胞术检测。目前已有可在裂殖酵母细胞质表达的两种高灵敏度H₂O₂生物传感器：roGFP2-Tpx1.C169S与HyPer7。仅HyPer家族成员可实现亚细胞定位靶向，例如将HyPer7与顺乌头酸酶1的线粒体靶向序列（MTS）融合，可将其递送至线粒体基质，研究显示基质稳态H₂O₂水平处于亚微摩尔范围（约0.15 μM），且线粒体基质与细胞质之间存在200:1的过氧化物梯度。该传感器已广泛用于解析不同遗传背景、药物处理与环境条件下的氧化还原动态。

1.2 监测代谢的体外实验方法

线粒体富集组分可用于体外研究线粒体功能，与活体研究结果形成互补验证。裂殖酵母线粒体富集流程通常始于酶法去除细胞壁制备原生质体，常用裂解酶为zymolyase，反应在含山梨醇等渗透压稳定剂的缓冲液中进行以防细胞裂解；随后通过玻璃匀浆器温和破碎原生质体，在保持细胞器完整性的前提下破坏质膜。后续主要采用两种分离策略：密度梯度离心（常用蔗糖梯度）依据浮力密度分离线粒体；差速离心通过逐步升高的转速依次富集线粒体组分，两类方法均利用线粒体与其他细胞组分的大小与密度差异。线粒体富集制剂保留充分的代谢活性，可用于多项下游分析：通过蓝绿温和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（BN-PAGE）解析ETC组成（1.2.1）、线粒体富集样本耗氧检测（1.2.2）、复合体IV活性酶学测定（1.2.3），相关技术路线见图1B。

1.2.1 BN-PAGE解析ETC组成与超复合物（SC）形成

BN-PAGE可保留天然蛋白质相互作用，用于解析线粒体ETC复合体与超复合物（SCs）的组成、组装与组织模式。裂殖酵母的SCs包括复合体III二聚体与1–2个复合体IV的关联形式。线粒体富集组分用温和非离子去污剂溶解：洋地黄皂苷可维持SCs完整性，十二烷基-β-D-麦芽吡喃糖苷（DDM）仅维持单个复合体完整性。样品上样至3%–12%丙烯酰胺天然梯度凝胶，电泳缓冲液含考马斯亮蓝作为蛋白上样对照。电泳结束后可通过胶内活性染色或复合体特异性抗体免疫印迹可视化目标条带。该方法可评估不同遗传背景、生长条件或药物处理下的ETC组成变化，揭示SCs组装、单个复合体化学计量比、复合体稳定性改变，这些信息无法通过变性SDS-PAGE检测，是将呼吸链结构组织与耗氧、ATP生成等功能结果关联的关键技术。

1.2.2 富集线粒体样本耗氧检测

线粒体富集组分可通过前述克拉克型氧电极进行体外耗氧检测，线粒体悬浮于含山梨醇等渗透压稳定剂的呼吸缓冲液中。呼吸反应通过添加ETC底物与共因子（如苹果酸与丙酮酸等NADH连接底物）及ADP启动，刺激氧化磷酸化。抗霉素A阻断复合体III电子流，FCCP消散质子梯度使电子传递最大化。耗氧检测结果需结合线粒体完整性与含量评估，常用柠檬酸合酶活性作为线粒体质量与品质的标志物，排除分离过程中线粒体回收率差异或损伤对结果的干扰。

1.2.3 复合体IV活性

单个呼吸链复合体活性可通过线粒体富集组分评估，复合体IV（细胞色素c氧化酶）活性可通过分光光度法与胶内活性染色两种互补方法检测。分光光度法通过监测还原型细胞色素c在550 nm处的氧化过程，反映复合体IV催化的电子传递给分子氧的反应，酶活性通常归一化至柠檬酸合酶活性。胶内活性染色则在BN-PAGE电泳后，将凝胶孵育于含还原型细胞色素c底物与3,3′-二氨基联苯胺（DAB）的反应缓冲液中，复合体IV催化细胞色素c氧化的同时引发DAB氧化聚合，在酶活性位点形成棕色沉淀，信号强度可归一化至总蛋白上样量。胶内活性测定的核心优势是可区分SCs组装内的复合体IV活性与游离单个复合体活性，同步提供结构与功能信息。

2 线粒体稳态

线粒体功能的正常执行依赖稳态的严格调控。线粒体是由内外两层膜构成的细胞器，分隔膜间隙与线粒体基质，同时是高度动态的区室，持续发生结构重塑以适应环境与代谢变化。从形态层面看，酵母线粒体通常形成贯穿细胞的相互连接的管状网络，高效分配能量与代谢产物。线粒体形态受数量变化与融合-分裂平衡的协同调控，两种相反过程的平衡对维持管状网络与整体功能至关重要。线粒体融合涉及内外膜的共同合并，由保守的线粒体融合蛋白介导：裂殖酵母的外膜融合主要受保守的mitofusin样GTP酶Fzo1调控，内膜融合依赖动力蛋白GTP酶Msp1。融合通过促进线粒体酶、代谢物与线粒体DNA的均匀分布，以及ROS在网络内的均衡化，支持呼吸代谢。fzo1与msp1缺失细胞因融合缺陷表现为极性片段化线粒体。与之相对，线粒体分裂是线粒体分离与质量控制的核心过程，裂殖酵母中由动力蛋白相关GTP酶Dnm1及其衔接蛋白（包括定位于外膜的Fis1）介导，负责招募分裂机器。分裂可将受损或功能失调的线粒体片段隔离，进而通过线粒体自噬选择性清除。fis1与dnm1缺失细胞显示分裂缺陷，线粒体呈过度融合的网络结构。裂殖酵母的线粒体自噬是选择性过程，依赖核心自噬机器但需线粒体特异性受体Atg43：该蛋白定位于线粒体外膜，介导线粒体识别与自噬降解靶向。通过线粒体自噬实现的线粒体周转对维持健康线粒体群体至关重要，是健康衰老的标志之一。除整体形态变化外，线粒体稳态还涉及嵴结构的重塑：嵴是线粒体内膜的向内凹陷结构，是氧化磷酸化复合体的组装平台。嵴的架构随呼吸需求变化，可从松散组织转变为高度致密的结构。高能量需求条件下，呼吸复合体重组为更高阶的组装体或SCs，如前所述的复合体III二聚体与1–2个复合体IV的关联形式。近期已解析裂殖酵母复合体IV的冷冻电镜结构。SCs的形成被认为可提高电子传递效率、减少电子泄漏与ROS生成、优化线粒体呼吸。本部分将阐述线粒体形态（2.1）与线粒体自噬（2.2）的核心实验方法，相关技术路线见图1C。

2.1 形态监测的实验方法

线粒体形态、动态与周转的调控对维持线粒体功能与整体细胞稳态至关重要。融合缺陷导致线粒体高度片段化，会严重损害有氧呼吸：此类细胞无法在非发酵性碳源上生长，因呼吸活性缺陷丢失线粒体膜电位，且线粒体蛋白导入受损，最终缩短时序寿命。因此精准评估线粒体稳态是解析线粒体功能的核心。

2.1.1 线粒体蛋白荧光标记

将GFP或mCherry等荧光标签与线粒体蛋白融合是活细胞可视化线粒体形态的常用策略。选择标记靶点时需确保融合蛋白不丧失功能、不破坏线粒体完整性，部分标签可能干扰线粒体活性，这类缺陷常表现为线粒体形态改变：管状网络丢失、片段化线粒体比例升高，常伴随呼吸能力下降。目前已证实可保留线粒体功能的标记策略包括琥珀酸脱氢酶亚基Sdh2的GFP或mCherry融合。线粒体形态可分为三类核心状态：管状（野生型样）、片段化、过度融合，也可观察到中间过渡形态。片段化线粒体可呈极性分布或遍布整个细胞。分析特定遗传背景或实验条件下的线粒体形态时，需纳入三类形态的标准参照：野生型细胞作为管状网络的参照；分裂缺陷突变体（如Δfis1或Δdnm1）作为过度融合线粒体的阳性对照，该类菌株显示延伸且高度互联的网络；融合缺陷突变体（如msp1缺失或标签化菌株）表现为高度片段化的线粒体结构，作为片段化形态的阳性对照。纳入这些明确的标准株系可实现不同实验背景下线粒体形态的稳健比较。

2.1.2 膜电位非依赖性线粒体染料

除基因编码荧光标签外，还可使用不依赖膜电位的线粒体染料可视化形态。MitoTracker Green FM是代表性探针，可与线粒体膜结合，无论线粒体能量状态如何均能标记，因此即使在线粒体膜电位受损（如呼吸缺陷突变体或呼吸链药理学抑制）的条件下仍可用于评估线粒体结构。使用时需优化染料浓度与孵育条件，最小化非特异性染色与光毒性效应。

2.2 线粒体自噬监测的实验方法

线粒体自噬是清除受损或功能失调线粒体的选择性过程，依赖核心自噬机器。该过程中，线粒体自噬受体Atg43定位于线粒体外膜，与自噬体形成机器组分互作，促进待降解线粒体被包裹进入液泡。氮饥饿与细胞衰老是酵母中线粒体自噬的经典诱导条件，在低糖培养基等呼吸条件下生长的细胞线粒体自噬水平升高，反映了其对有氧呼吸的更高依赖及维持健康线粒体库的周转需求。

2.2.1 免疫印迹

线粒体自噬激活可通过免疫印迹检测线粒体靶向荧光融合蛋白的切割产物。常用的报告系统是前述琥珀酸脱氢酶亚基Sdh2的GFP或mCherry融合，需确保融合蛋白不干扰线粒体功能或形态，避免间接影响自噬。基础条件下免疫印迹可检测到全长融合蛋白；自噬诱导后，线粒体被递送至液泡，大部分线粒体蛋白被降解，但GFP因折叠稳定对液泡蛋白酶相对抵抗，会积累为游离GFP条带，作为线粒体自噬的生化读数。阳性对照包括氮饥饿处理约16小时，或在低糖培养基（如含1%葡萄糖的YE5S）中培养至静止期（2–3天），此类条件下可稳定检测到游离GFP积累。

2.2.2 荧光显微镜

另一种策略基于荧光显微镜技术，评估线粒体与液泡标记物的共定位，作为线粒体递送至液泡的读数。线粒体可通过Sdh2-GFP/mCherry标记，液泡可通过液泡驻留水解酶羧肽酶Y（Cpy1）等液泡蛋白的异色荧光标记实现。自噬诱导条件下，线粒体荧光信号预期与液泡信号共定位，表明线粒体被隔离至液泡内。与免疫印迹一致，需设置阳性对照验证自噬诱导：包括氮饥饿至少16小时的细胞，以及在低糖呼吸条件下时序衰老的细胞（如含1%葡萄糖的YE5S培养3天），此类条件可稳健诱导线粒体自噬，便于显微镜共定位结果的判读。

3 结论

近年来，裂殖酵母已成为解析线粒体功能的有力且多功能的模型。其即使在发酵条件下也对有氧呼吸存在必需依赖性，使该体系非常适合解析接近哺乳动物细胞的调控机制。当前裂殖酵母中尚未充分探索的研究方向包括线粒体蛋白导入、线粒体蛋白合成、线粒体在胞质蛋白质量控制中的作用、线粒体蛋白质组定量分析、线粒体蛋白互作的深度解析等。本综述讨论的实验策略实现了呼吸活性、能量状态、氧化还原平衡与细胞器结构的整合分析，可在活细胞与分离线粒体中系统解析线粒体功能，确立了裂殖酵母作为探索线粒体组织与行为如何塑造细胞代谢与适应性响应的理想模型。