分次低剂量电离辐射通过mtROS-ERS-MQC轴诱导人心血管内皮细胞衰老

《Radiation Medicine and Protection》：Fractionated low-dose ionizing radiation induces senescence of human cardiovascular endothelial cells through the mtROS-ERS-MQC axis

　　

目的 研究人员旨在探讨分次低剂量电离辐射（fractionated low-dose ionizing radiation, LDIR）对人心血管内皮细胞（EA.hy926）中细胞衰老以及线粒体活性氧（mitochondrial reactive oxygen species, mtROS）–内质网应激（endoplasmic reticulum stress, ERS）–线粒体质量控制（mitochondrial quality control, MQC）轴相关标志物表达水平的影响。方法 将EA.hy926细胞分别以0 mGy、25 mGy、50 mGy和100 mGy的剂量照射5次，并在第5次X射线照射后继续培养48 h。使用衰老相关β-半乳糖苷酶（senescence-associated β-galactosidase, SA-β-gal）染色评估衰老水平；通过蛋白质印迹（Western blot）分析与衰老、ERS和MQC相关的蛋白水平；通过荧光染色评估mtROS、线粒体Ca²⁺、线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential, MMP）以及线粒体通透性转换孔（mitochondrial permeability transition pore, MPTP）的开放程度。结果 与对照组相比，50 mGy×5组（1.85±0.09）和100 mGy×5组（2.60±0.20）中SA-β-gal阳性细胞百分比显著增加（F=107.50，P<0.01）；100 mGy×5组中衰老相关P53、P21和P16的蛋白水平均显著升高（1.31±0.08、1.54±0.04、1.68±0.06；F=26.68、10.30、19.23；P<0.05）；100 mGy×5组中ERS相关标志物PERK和GRP78的蛋白水平均显著升高（1.71±0.34、1.31±0.06；F=7.81、15.27；P<0.05）。与对照组相比，50 mGy×5组（2.03±0.18）和100 mGy×5组（3.02±0.22）中mtROS水平显著升高（F=117.90，P<0.01），100 mGy×5组中MQC相关PGC-1α、MFN2、MFN1、DRP1、Parkin和PINK1的蛋白水平均显著升高（F=5.64～17.48；P<0.05）。与未处理对照组相比，所有剂量组的线粒体Ca²⁺水平均显著升高（F=821.40，P<0.01）；所有剂量组的线粒体膜电位均显著降低（F=58.30，P<0.01）；50 mGy和100 mGy组中线粒体通透性转换孔开放程度显著增加（F=10.58，P<0.01）。SA-β-gal阳性细胞百分比与mtROS、ERS、线粒体功能障碍和MQC系统失调的指标呈正相关（P<0.05）。结论 分次LDIR可诱导人心血管内皮细胞衰老，导致mtROS-ERS-MQC轴相关标志物发生变化。

论文解读文章

研究背景：低剂量电离辐射（LDIR）是指外照射剂量低于100 mGy或剂量率低于0.1 mGy/min的X/γ射线。联合国原子辐射效应科学委员会（UNSCEAR）对其进行了定义。LDIR的健康效应主要包括致癌效应和非致癌效应，其中非致癌效应涉及特定靶器官疾病和心血管疾病（CVDs），如缺血性心脏病和卒中。核工业工人的队列研究一致表明，LDIR暴露可能增加非癌症死亡风险，尤其是心脑血管疾病。长期职业或环境LDIR暴露可能是CVDs的潜在风险因素，但两者关联及潜在机制仍未阐明。细胞衰老主要由应激性损伤和某些生理过程触发，其机制涉及氧化应激、DNA损伤和线粒体损伤。已有研究证明，LDIR可导致人血管内皮细胞DNA损伤增加、氧化应激水平升高、抑制细胞增殖能力，并诱导早熟衰老。内质网（ER）是最大的细胞器，参与蛋白质折叠、翻译和结构成熟等生物过程。当细胞发生氧化应激和钙稳态失衡时，会导致错误折叠蛋白积累，触发内质网应激（ERS），进而激活未折叠蛋白反应（UPR）。线粒体功能缺陷与衰老及年龄相关疾病密切相关，线粒体质量控制（MQC）在心血管衰老中可能发挥关键作用。内质网和线粒体在生理和病理上高度相关，通过线粒体相关内质网膜（MAM）传递Ca²⁺和活性氧信号。持续的ERS导致线粒体Ca²⁺过度内流，加剧mtROS产生，严重损伤线粒体功能。衰老引起的线粒体稳态紊乱共同促进CVDs的发生发展。本研究旨在建立分次LDIR诱导人心血管内皮细胞衰老模型，探讨分次LDIR通过mtROS-ERS-MQC轴调控细胞衰老的作用，为长期LDIR诱导心血管衰老的机制研究提供实验证据，并为效应标志物研究提供新方向。该论文发表在《Radiation Medicine and Protection》。

研究人员开展的研究与结论：研究人员利用人脐静脉内皮衍生细胞系EA.hy926（购自美森细胞科技有限公司），以0、25、50、100 mGy的剂量进行5次间隔48 h的X射线照射，建立分次LDIR暴露模型。通过SA-β-gal染色、Western blot和多种荧光染色技术检测细胞衰老、mtROS、ERS、MQC及线粒体功能相关指标，并进行相关性分析。研究结论：分次LDIR可诱导心血管内皮细胞衰老，并伴随mtROS-ERS-MQC轴相关标志物水平的变化，表现为mtROS升高、ERS激活、线粒体动力学失衡、线粒体自噬过度、线粒体功能障碍，且衰老标志物与这些指标显著相关。该研究揭示了分次LDIR可能通过mtROS-ERS-MQC轴破坏线粒体功能稳态从而促进衰老，为LDIR与CVDs的关联提供了细胞水平的机制线索。

关键的技术方法（不超过250字）：研究人员采用EA.hy926人心血管内皮细胞系（购自Meisen Cell Technology Co., Ltd.），使用X射线辐照仪（Xstrahl CIX3，电压300 kV，电流10 mA，1.0 mm铜过滤，剂量率0.7577 Gy/min）进行分次照射（0、25、50、100 mGy，共5次，每次间隔48 h）。主要技术方法包括：（1）细胞衰老检测：SA-β-gal染色及ImageJ定量分析；（2）蛋白表达分析：Western blot检测衰老相关蛋白（P53、P21、P16）、ERS标志物（PERK、GRP78）和MQC相关蛋白（PGC-1α、TFAM、DRP1、MFN1、MFN2、PINK1、Parkin）；（3）线粒体功能检测：荧光染色法测定mtROS（MitoSOX Red）、线粒体Ca²⁺（Rhod-2AM）、线粒体膜电位（JC-1）和线粒体通透性转换孔开放程度（Calcein AM/CoCl₂）；（4）统计分析：单因素方差分析（ANOVA）结合Dunnett事后检验，Spearman相关性分析。

研究结果：
3.1 分次LDIR对细胞衰老的影响：通过SA-β-gal染色和Western blot检测发现，单次照射后各剂量组衰老细胞比例和衰老相关蛋白无显著变化（P>0.05），而分次照射后，50 mGy×5组和100 mGy×5组SA-β-gal阳性细胞比例显著增加（P<0.01），100 mGy×5组P53、P21和P16蛋白水平均显著升高（P<0.05），25 mGy×5组P53和P21也显著升高，所有剂量组P16均显著升高。说明分次LDIR通过P53/P21通路和/或P16通路诱导细胞衰老。
3.2 分次LDIR对mtROS和ERS水平的影响：荧光染色显示，50 mGy×5组和100 mGy×5组mtROS水平显著升高（P<0.01）。Western blot结果显示，100 mGy×5组PERK蛋白水平显著升高（P=0.01），所有剂量组GRP78蛋白水平均显著升高（P<0.01）。表明分次LDIR诱导mtROS产生并激活ERS的PERK/GRP78通路。
3.3 分次LDIR对MQC指标的影响：Western blot结果显示，与对照组相比，100 mGy×5组PGC-1α蛋白水平显著升高（P<0.05）；50 mGy×5组和100 mGy×5组MFN2和MFN1蛋白水平显著降低（P<0.05），DRP1、Parkin和PINK1蛋白水平显著升高（P<0.05），TFAM蛋白水平显著升高（P<0.05）。提示分次LDIR导致线粒体生物发生代偿性增加、融合减少、分裂增加以及自噬过度。
3.4 分次LDIR对线粒体功能的影响：荧光染色定量分析显示，所有剂量组线粒体Ca²⁺水平显著升高（P<0.05）；所有剂量组线粒体膜电位（JC-1单体/聚集体荧光比值）显著降低（P<0.05）；50 mGy×5组和100 mGy×5组线粒体通透性转换孔（MPTP）荧光强度显著降低（即开放程度增大，P<0.05）。表明分次LDIR引起线粒体Ca²⁺超载、膜电位下降及MPTP开放增强，导致线粒体功能障碍。
3.5 细胞衰老标志物与mtROS-ERS-MQC轴指标的相关性：Spearman相关性分析显示，SA-β-gal阳性细胞比例与mtROS水平、PERK蛋白水平、线粒体Ca²⁺水平、PGC-1α、TFAM、DRP1、PINK1和Parkin蛋白水平呈正相关（P<0.05）；与线粒体膜电位、MPTP关闭程度、MFN2和MFN1蛋白水平呈负相关（P<0.05）。证实细胞衰老程度与mtROS-ERS-MQC轴的整体失调密切相关。

总结讨论部分：研究人员指出，分次LDIR可诱导心血管内皮细胞衰老，并伴随mtROS-ERS-MQC轴标志物的改变，从而影响线粒体功能稳态。这一过程涉及P53/P21通路的早期应答和P16通路的延迟诱导，mtROS是氧化应激的主要来源，ERS通过PERK通路激活UPR。MQC方面，线粒体融合蛋白MFN1/MFN2表达降低、分裂蛋白DRP1升高、自噬蛋白PINK1/Parkin升高，提示线粒体动力学失衡和过度自噬，导致线粒体生物发生代偿性增加。线粒体Ca²⁺超载降低膜电位并促进MPTP开放，进一步损害线粒体功能。相关性分析支持以上轴的协同作用。研究存在局限性：仅使用EA.hy926细胞系，未能完全反映原代人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的效应；未进行内皮细胞功能检测；未检测细胞外衰老相关分泌表型（SASP）因子。未来将采用体内外模型验证该轴在分次LDIR诱导心血管衰老中的作用。研究结论：分次LDIR可诱导人心血管内皮细胞衰老，导致mtROS-ERS-MQC轴相关标志物发生变化。