酸枣(Ziziphus jujuba var. spinosa)中生长调控因子(Growth-regulating factor, GRF)家族的全基因组鉴定与表达分析

《Scientia Horticulturae》：Genome-wide identification and expression analysis of the growth-regulating factor (GRF) family in Ziziphus jujuba var. spinosa

　　

生长调控因子（Growth-regulating factor, GRF）是植物特有的转录因子，参与调控植物生长、发育及逆境响应。研究人员对酸枣（Ziziphus jujuba var. spinosa）中GRF家族进行了全基因组水平的鉴定与特征分析。共鉴定到11个GRF基因（ZjsGRF1–ZjsGRF11），其编码蛋白均含有保守的QLQ（Gln–Leu–Gln）结构域和WRC（Trp–Arg–Cys）结构域。系统发育分析将其划分为6个亚支，同一亚支内成员具有相似的基序（motif）组成及外显子–内含子结构。全基因组加倍（whole-genome duplication, WGD）和片段重复（segmental duplication）是该类基因家族扩张的主要驱动力，净化选择（purifying selection）维持了进化过程中功能的稳定性。除ZjsGRF9外，其余所有成员在WRC结构域内均含有miR396结合位点，提示存在转录后调控。蛋白互作预测表明多数ZjsGRF与GRF互作因子（GRF-interacting factor, GIF）相互作用，暗示其参与保守的miR396–GRF/GIF调控模块。启动子顺式作用元件分析显示激素及逆境响应元件显著富集。转录组及实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR, qRT-PCR）分析表明，ZjsGRF2和ZjsGRF7在转色初期及红果期高表达，ZjsGRF5和ZjsGRF11主要在种子中优势表达。在干旱、盐、脱落酸（abscisic acid, ABA）及茉莉酸甲酯（methyl jasmonate, MeJA）处理下，ZjsGRF基因呈现显著差异表达。本研究为酸枣GRF基因功能解析奠定基础，并为改良酸枣果树果实发育及抗逆性的分子育种提供候选基因。

酸枣(Ziziphus jujuba var. spinosa)GRF基因家族全基因组鉴定与表达分析的解读——发表于《Scientia Horticulturae》

研究背景与意义

生长调控因子（Growth-regulating factor, GRF）是植物特有转录因子，含保守N端QLQ（Gln–Leu–Gln）结构域和WRC（Trp–Arg–Cys）结构域，通过miR396–GRF/GIF调控模块控制细胞增殖、器官大小及逆境适应。酸枣耐旱耐盐碱，兼具生态恢复与药用经济价值，但其GRF家族尚无人系统研究。研究人员对酸枣GRF家族进行全基因组鉴定、进化、结构、miRNA靶标、互作网络、启动子元件及组织/胁迫表达谱分析，为解析果实发育和抗逆分子机制提供候选基因。

主要关键技术方法

研究人员以GenBank（GCA_037113545.1）及figshare中酸枣基因组为数据源，以拟南芥（Arabidopsis thaliana）AtGRF蛋白为查询序列行BLASTP（E≤1×10^?5），并用HMMER搜索PF08880（QLQ）和PF08879（WRC）隐马尔可夫模型筛选含双结构域的候选基因并由NCBI CDD验证。蛋白理化性质用EXPASY ProtParam计算，亚细胞定位用Plant-mPLoc预测，二级/三级结构分别用SOPMA和SWISS-MODEL建模。多物种GRF蛋白用MUSCLE比对并以最大似然法（Maximum Likelihood, JTT+G+I+F模型，1000次自举）建系统树，用TBtools做基因结构、MEME基序、染色体定位及MCScanX共线分析，Ka/Ks计算与分歧时间估算（Ks/2r，r=1.5×10^?8）。miR396靶标用psRNATarget预测，蛋白互作用用STRING建网。启动子顺式元件用PlantCARE分析。表达谱源自公共RNA-seq（SRP465143等）用RSEM定量（TPM），热力图用TBtools绘制。幼苗经15% PEG6000（模拟干旱）、150 mM NaCl、100 μM ABA、1 mM MeJA处理，取样0/6/12/24 h，用qRT-PCR（内参ACTIN7，2^?ΔΔCt法）验证，SPSS做单因素方差分析与Tukey HSD检验。

研究结果

3.1. Identification of ZjsGRF family members（ZjsGRF家族成员的鉴定）

通过基因组筛查共鉴定11个ZjsGRF基因（ZjsGRF1–ZjsGRF11），编码226–624 aa蛋白，分子量25.21–67.26 kDa，等电点＞7（碱性蛋白），均为亲水性不稳定蛋白，除ZjsGRF6预测定位于细胞壁和细胞核外，其余10个定位于细胞核。

3.2. Conserved motifs and gene structure analysis of the ZjsGRF gene family（ZjsGRF基因家族保守基序与基因结构分析）

系统发育分为六支，同支成员基序组成相似；Motif 1、2分别对应WRC和QLQ结构域，ZjsGRF6含两个WRC结构域，部分C端含FFD/TQL/GGPL基序；ZjsGRF9含2个外显子，ZjsGRF1/ZjsGRF10含3个，其余均含4个外显子。

3.3. Phylogenetic tree analysis of ZjsGRF gene family members（ZjsGRF基因家族系统发育树分析）

跨物种进化树分六大组（Group I–VI），ZjsGRF与栽培枣（Z. jujuba 'Dong Zao'）ZjdGRF紧密聚簇，且与蔷薇科苹果、梨GRF近缘；Group III仅含双子叶植物GRF，Group VI单双子叶各有独立分支且含AtGRF9和SlyGRF8，提示该支可能为单双子叶分化前古老谱系。

3.4. Synteny and selection pressure analyses（共线性与选择压力分析）

ZjsGRF3/ZjsGRF10/ZjsGRF11源于分散重复（dispersed duplication），其余8个源于WGD/片段重复，后者是家族扩张主因。四对共线基因对Ka/Ks均＜1，受净化选择；Ks推算分歧时间约41.44–57.50 百万年前（Mya）。酸枣与栽培枣、苹果、拟南芥、水稻分别找到19、23、10、6对GRF共线对，所有ZjsGRF在栽培枣中有直系同源基因。

3.5. miRNA target analysis of ZjsGRF genes（ZjsGRF基因miRNA靶标分析）

除ZjsGRF9外，其余10个ZjsGRF基因CDS区WRC结构域内含miR396结合位点，少数还预测受miR2950、miR159靶向，符合植物中保守的miR396–GRF调控模式。

3.6. Protein–protein interaction network prediction（蛋白互作网络预测）

ZjsGRF1/2/4/5/7/8/11与GIF1/2/3互作，ZjsGRF9仅与GIF1互作；ZjsGRF3/6/10未预测到与GIF互作；ZjsGRF8与VQ-like蛋白、ZjsGRF11与bHLH-like蛋白潜在互作，提示部分成员可能参与非经典调控通路。

3.7. Analysis of cis-acting elements in ZjsGRF gene promoters（ZjsGRF基因启动子顺式作用元件分析）

启动子富含光响应元件（Box 4、G-Box），激素响应元件（ABRE—ABA响应；CGTCA-motif/TGACG-motif—MeJA响应；ERE—乙烯响应）及逆境响应元件（ARE厌氧诱导、MYB/MYC结合位点、STRE、WRE3），表明ZjsGRF可整合激素与逆境信号。

3.8. Expression pattern analysis of the ZjsGRF gene family during fruit development（果实发育过程中ZjsGRF基因家族表达模式分析）

转录组显示ZjsGRF2和ZjsGRF7在果实转色初期（A2）和完熟红果期（A5）高表达，提示参与果实膨大与成熟物质积累；ZjsGRF3/ZjsGRF10随发育渐升；ZjsGRF5/ZjsGRF11在种子中特异高表达，暗示调控种子发育或代谢。

3.9. Expression analysis of ZjsGRF genes under drought and salt stress（干旱与盐胁迫下ZjsGRF基因表达分析）

PEG模拟干旱下叶中ZjsGRF1持续上调、ZjsGRF11在12 h达峰、ZjsGRF4/ZjsGRF7先升后降，ZjsGRF6/ZjsGRF8被抑制；根中ZjsGRF9快速响应升高后回落，ZjsGRF6持续抑制，其余先抑后升。盐胁迫下叶中ZjsGRF2/3/6/8/9在12 h上调（ZjsGRF9约6倍），根中ZjsGRF4/7/8持续上调而ZjsGRF9被抑制，体现组织特异性调控。

3.10. Expression analysis of ZjsGRF genes in response to phytohormone treatments（植物激素处理下ZjsGRF基因表达分析）

ABA处理后叶中ZjsGRF1/10/11在24 h诱导，ZjsGRF9持续抑制；根中多数早期抑制后期恢复，ZjsGRF2/5/8在24 h诱导。MeJA处理后叶中ZjsGRF7强诱导（12 h达峰），多数成员24 h上调；根中ZjsGRF8/9受抑，ZjsGRF2/3/6/10在12–24 h诱导，表明ZjsGRF与MeJA信号通路密切关联。

讨论与结论总结

讨论指出酸枣鉴定到11个GRF成员，数量与已报道陆生植物相当；ZjsGRF6具双WRC结构域类似AtGRF9，或具独特功能。系统发育、基序及基因结构佐证分组可靠性，与枣及蔷薇科GRF近缘，跨物种共线性证实进化保守性。WGD/片段重复驱动扩张，Ka/Ks＜1示净化选择，分歧时间约41–58 Mya，部分基因可追溯至单双子叶分化前。除ZjsGRF9外均含miR396靶点，多数ZjsGRF与GIF互作，支持保守miR396–GRF/GIF模块存在；少数无GIF互作成员可能功能分化。启动子富集激素与逆境元件，ZjsGRF2/7可能与果实晚期发育有关，ZjsGRF5/11与种子相关，不同成员在干旱/盐/ABA/MeJA下呈组织与时间特异性差异表达，暗示协同调控逆境适应。

结论（翻译）：研究人员通过全基因组分析成功鉴定酸枣中11个GRF转录因子基因（ZjsGRF1–ZjsGRF11），依结构和系统发育特征分为六个亚支。ZjsGRF家族的基因结构、保守基序及预测蛋白互作高度保守。共线性分析鉴定四对共线基因对均受净化选择，表明家族功能在进化中保守。表达谱显示ZjsGRF成员在果实发育和种子形成中具有组织特异性表达模式，指向其在酸枣非生物逆境适应中的潜在作用，可能通过保守的miR396–GRF/GIF调控模块及激素介导的信号通路实现。