茅栗（Castanea seguinii Dode）植株再生及遗传转化体系的建立

《Scientia Horticulturae》：Establishment of regeneration and genetic transformation protocols for Castanea seguinii Dode

　　

摘要：体细胞胚胎发生（Somatic embryogenesis, SE）是种质改良的常用手段，但板栗（Castanea mollissima Blume）的SE萌发率较低。为解决此问题，研究人员探究了与其近缘且具短童期的茅栗（C. seguinii Dode）的应用潜力。比较分析显示，茅栗不定芽的增殖系数是板栗的2倍。鉴于茅栗在加速栗属研究与育种计划中的前景，研究人员以未成熟胚为外植体，建立了茅栗体细胞胚胎再生及遗传转化体系。优化后的方案显示愈伤组织诱导率为31.6%，子叶期胚萌发率为12.5%，从愈伤组织诱导至体细胞胚萌发全程需17周。值得注意的是，农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）瞬时转化率达19.9%；稳定转化效率在12周内（从愈伤组织初次侵染、获得转基因愈伤组织到最终产生转基因苗）可达13.04%。此外，转基因植株的根系能够与彩色豆马勃（Scleroderma citrinum）建立与野生型相同的共生关系。本研究为木本植物尤其是栗属植物的分子设计育种及外生菌根（Ectomycorrhizal, ECM）共生基础研究提供了一个替代实验平台。

《Scientia Horticulturae》论文解读——茅栗（Castanea seguinii Dode）体细胞胚胎发生再生及农杆菌介导遗传转化体系的建立

一、研究背景与意义

板栗（Castanea mollissima Blume，即中国板栗）在我国有悠久栽培历史及较高经济与生态价值，且抗病性与抗逆性较强。然而，板栗存在增殖及遗传转化效率低的问题，制约了其果实发育及抗性性状分子机理的研究。茅栗（C. seguinii Dode）是与中国板栗近缘的物种，分布于中国南方，具有短童期（播种当年即可开花结果）的特点，有望成为研究栗属分子机制的良好实验材料，但目前缺乏其高效无性繁殖及稳定遗传转化体系。美洲板栗（C. dentata）、欧洲板栗（C. sativa）及中国板栗已有相关繁殖与转化方法报道，研究人员假设茅栗的植株再生及转化效率高于其他栗属物种，因此在本研究中建立了茅栗的体细胞胚胎发生（Somatic Embryogenesis, SE）再生及农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导遗传转化体系，并验证转基因植株形成外生菌根（Ectomycorrhizal, ECM）的能力。

二、主要关键技术方法

研究以贵州省贵阳市乌当区林地采集的花后40～60天未成熟茅栗坚果为材料诱导胚性愈伤组织；以实验室培养的茅栗及'燕山红栗'品种中国板栗幼嫩茎段为材料进行不定芽增殖系数比较。愈伤组织诱导采用固体及液体IMM培养基（Induction Medium，基于McCown木本植物培养基WPM），胚性愈伤维持筛选最适6-BA与2,4-D组合的E1培养基，体细胞胚发育采用E2培养基，萌发采用含6-BA、NAA等的E4培养基。遗传转化使用携带含CaMV 35S启动子驱动增强型绿色荧光蛋白（enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP）基因质粒的农杆菌GV3101菌株，通过共培养、抗生素除菌及潮霉素B筛选获得转基因愈伤与植株，经荧光显微镜观测及PCR鉴定。转基因苗炼苗后接种彩色豆马勃（Scleroderma citrinum），进行外生菌根（Ectomycorrhiza, ECM）共生形成观察及半薄切片显微分析。

三、研究结果

3.1. 茅栗茎段较中国板栗具更高增殖系数（High propagation coefficient of shoots in C. seguinii compared to Chinese chestnut）

研究人员将茅栗与中国板栗'燕山红栗'幼嫩茎段培养于增殖培养基（含0.5 μmol/L 6-BA的WPM培养基）4周后统计增殖系数〔(不定芽总数－初始芽数)/初始芽数〕。结果显示茅栗增殖系数为2.71，是中国板栗（1.38）的约2倍，表明茅栗具更强的器官发生能力，适合作为栗属快速繁殖及种质保存的材料。

3.2. 茅栗胚性愈伤组织的诱导与维持（Induction and maintenance of embryogenic callus of C. seguinii）

以212枚未成熟胚尖为起始外植体，经IMM固体培养基4周及液体IMM培养基2周诱导后转至E2培养基，获得67块胚性愈伤组织，愈伤诱导率为31.6%。为克服胚性愈伤褐化及胚性丧失问题，研究人员测试了表1中20种不同6-BA（0～3.3 μM）与2,4-D（0～7.2 μM）浓度组合（CS1～CS20）的E1固体培养基对0.05 g过0.154 mm钢网筛的胚性愈伤的维持效果，从愈伤颜色（白黄至褐）、紧实度（疏松至紧密）及维持能力评分。结果表明CS16处理（2.2 μM 6-BA + 3.6 μM 2,4-D）最有效地减轻褐化，愈伤呈鲜黄紧凑或略疏松状态，且后续体细胞胚胎发生能力最强，确定为茅栗胚性愈伤继代与维持的最适激素组合。

3.3. 茅栗体细胞胚发育与萌发（Somatic embryo development and germination of C. seguinii）

将维持的胚性愈伤转至E2固体培养基暗培养（23～25℃）4周，7天出现球型胚，4周出现子叶期胚。将成熟子叶期胚移至E4萌发培养基（16 h/8 h 光/暗），1周变绿，2周生根并出现茎端分生组织，4周成苗。统计120个子叶期胚中15个萌发出苗，萌发率为12.5%，高于已报道中国板栗在固体培养基上的2.2%，表明成功建立了茅栗SE再生体系，全程从愈伤诱导至体细胞胚萌发约17周。

3.4. 基于茅栗体细胞胚的遗传转化（Genetic transformation based on C. seguinii somatic embryos）

用含35S::EGFP质粒的农杆菌GV3101侵染E2培养基培养约1周的体细胞胚（切开后菌液共培养3～4 h，OD₆₀₀＝0.8～1.2），共培养2天后转至含头孢噻肟（50 mg/L）、替门汀（500 μM）及潮霉素B（70 mg/L）的E1筛选培养基。12天可观察到EGFP荧光，检测300块愈伤中59块EGFP阳性，瞬时转化率为19.9%，显著高于中国板栗报道值（4.5%）。转基因愈伤转E2诱导胚、再转E4成苗，560个转基因子叶期胚中获得73株转基因苗，稳定转化效率（成苗率）为13.04%，高于中国板栗（＜1%）。随机取24株转基因苗进行EGFP特异引物PCR扩增，100%检出EGFP条带，证实外源基因整合。

3.5. 转基因茅栗根系形成外生菌根（Formation of ectomycorrhizal roots on transgenic C. seguinii root）

将具良好根系的转基因茅栗苗（含EGFP空载）与野生型对照接种Scleroderma citrinum，1个月后均形成外生菌根。半薄纵切片显微镜观察显示转基因外生菌根具典型菌套（mantle）及哈氏网（Hartig net），皮层细胞膨大，结构与野生型外生菌根一致，证明农杆菌介导转化的茅栗植株仍保留与ECM真菌建立共生关系的能力，可用于栗属外生菌根分子互作研究。

四、讨论与结论总结

讨论指出，本研究成功建立茅栗再生与遗传转化体系，其较高再生与转化效率使之成为栗属研究的优良实验平台。茅栗子叶期胚可直接生根，省去其他栗属后期单独生根步骤，缩短获得完整植株时间约1个月，结合短童期特点适于基因功能快速研究及加速育种。虽茅栗子叶胚萌发率低于欧/美板栗，未来拟筛选高再生基因型并建立CRISPR/Cas9基因编辑体系以进一步拓展应用。

结论译为：本研究成功建立了茅栗（C. seguinii）的植株再生及遗传转化体系。其较高的再生与转化效率使茅栗成为栗属研究的优良实验平台。该工作不仅为栗属研究奠定坚实基础，也为木本植物基础研究提供了替代途径。