《Scientia Horticulturae》：Transcription factor MdBBX51 directly and indirectly mediates ALA-induced anthocyanin accumulation in apple
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光作为一种关键的环境信号，在整个生命周期中调节植物生长发育。BBX转录因子已成为光信号转导的关键介导因子。在苹果（Malus × domestica Borkh.）中，果皮着色主要由花青素积累决定。这些色素在决定果实颜色方面至关重要，直接影响果实的商业吸引力并
光作为一种关键的环境信号，在整个生命周期中调节植物生长发育。BBX转录因子已成为光信号转导的关键介导因子。在苹果（Malus × domestica Borkh.）中，果皮着色主要由花青素积累决定。这些色素在决定果实颜色方面至关重要，直接影响果实的商业吸引力并提供重要的营养益处。5-氨基乙酰丙酸（ALA）作为一种天然存在的植物生长调节剂，已被证明通过刺激花青素生物合成来增强红色色素沉着；然而，对其相关分子机制的理解仍存在显著空白。在本研究中，研究人员探索了MdBBX51，一种苹果B-box转录因子，其表达在果实和叶片中均与ALA诱导的花青素积累强烈相关，表明其参与生物合成途径的调控。MdBBX51定位于细胞核，其启动子受外源ALA激活。MdBBX51的过表达导致花青素积累增强，而RNA干扰（RNAi）介导的MdBBX51抑制显著降低了ALA诱导的色素沉着。通过酵母单杂交（Y1H）、荧光素酶报告基因（LUC）和电泳迁移率变动分析（EMSA），研究人员确定MdBBX51直接结合MdCHS、MdDFR和MdMYB9的启动子，从而激活基因表达。因此，研究人员提出MdBBX51可以直接上调结构基因（如MdCHS和MdDFR）以及调控基因（如MdMYB9）的表达，间接促进ALA诱导的花青素积累。这些结果为基础研究以及ALA在高质量果实栽培中的应用奠定了坚实的理论基础，并有助于加深对色素沉着转录调控的理解。
苹果果皮着色主要由花青素积累决定，直接影响果实商业价值和营养品质。5-氨基乙酰丙酸（ALA）作为一种天然植物生长调节剂，可诱导花青素生物合成，但其分子机制尤其是BBX转录因子的参与尚不明确。针对这一不足，本研究系统探究了MdBBX51在ALA诱导苹果花青素积累中的作用。研究人员通过系统发育分析、表达谱分析、瞬时和稳定遗传转化、酵母单杂交（Y1H）、电泳迁移率变动分析（EMSA）、双荧光素酶报告基因（LUC）和GUS染色等技术，证明了MdBBX51是正调控因子，直接结合MdCHS、MdDFR和MdMYB9启动子，直接和间接促进花青素积累。该研究揭示了新的调控通路，为ALA在优质果实栽培中的应用奠定了理论基础，论文发表在《Scientia Horticulturae》。
关键技术方法方面，本研究使用的植物材料包括苹果（Malus × domestica）‘Huashuo’果实（采自江苏省丰县果园）、‘GL-3’组培苗和‘Orin’愈伤组织（由山东农业大学提供）。主要技术涉及：系统发育与顺式元件分析、亚细胞定位（GFP融合蛋白）、农杆菌介导的瞬时转化（果实和叶片）及稳定转化（愈伤组织）实现MdBBX51过表达和RNA干扰（RNAi）、RT-qPCR分析基因表达、Y1H、EMSA、LUC、GUS染色用于验证启动子结合与转录激活，以及酵母双杂交（Y2H）和荧光素酶互补成像（LCI）用于蛋白互作验证。
研究结果部分共包含8个子标题，具体如下：
3.1 系统发育树与顺式元件分析：通过构建苹果MdBBX家族（64个成员）系统发育树，发现MdBBX51属于第IV组，该组包含已知参与花青素积累的MdBBX21和MdBBX22。进一步分析第IV组成员启动子中的光响应元件，显示MdBBX51含有11个光响应元件，提示其可能参与光信号响应。
3.2 ALA上调MdBBX51表达诱导果实着色：外源ALA处理‘Huashuo’苹果果实后，果皮红色加深，花青素含量在48小时和72小时分别提高1.7倍和2.4倍。RT-qPCR筛选第IV组MdBBX基因，仅MdBBX51表达受光诱导并被ALA进一步增强。GUS染色显示ALA显著增强MdBBX51启动子活性，证实ALA通过激活启动子促进MdBBX51转录。
3.3 比较分析与亚细胞定位：系统发育比较显示MdBBX51与草莓FaBBX24、梨PpBBX24、石榴PgBBX5等已知调控花青素的BBX蛋白高度同源（相似性分别为77.9%、78.0%、65.0%），且含有保守的B-box1和B-box2结构域。亚细胞定位实验显示MdBBX51-GFP融合蛋白特异性定位于细胞核，符合转录因子特征。
3.4 MdBBX51正调控苹果果实和叶片花青素积累：在‘Huashuo’果实和‘GL-3’叶片中瞬时过表达MdBBX51显著增强红色着色，而RNAi抑制则减弱着色。定量分析表明过表达促进花青素积累，抑制则减少。基因表达分析显示过表达上调结构基因（MdCHS、MdF3H、MdDFR、MdANS、MdUFGT）和转运基因（MdGSTF12、MdMATE8），而RNAi下调这些基因。在叶片中外源ALA进一步促进过表达系的着色，但对RNAi系拯救效果有限，表明MdBBX51在ALA诱导过程中的关键作用。
3.5 ALA诱导的MdBBX51正调控愈伤组织花青素积累：稳定转化‘Orin’愈伤组织，过表达MdBBX51较野生型积累更多花青素，RNAi则严重受损。ALA处理进一步增加过表达系的花青素含量，但RNAi系反应微弱。基因表达分析显示过表达上调上述结构基因和转运基因，RNAi则抑制，ALA增强过表达系表达但不能逆转RNAi系的抑制。此外，过表达MdBBX51还上调了多个ALA相关转录因子基因（MdMYB1/9/10、MdbHLH33、MdMADS1、MdNAC33、MdERF78、MdHsfB3a、MdWRKY71），RNAi则下调，表明MdBBX51位于MBW和非MBW通路上游。
3.6 MdBBX51结合MdCHS和MdDFR启动子激活转录：通过分析启动子中的G-box（CACGTG）元件，发现MdCHS和MdDFR启动子各含一个G-box。Y1H实验显示MdBBX51特异结合MdCHS和MdDFR启动子，但不结合MdF3H、MdANS、MdUFGT、MdMATE8、MdGSTF12。EMSA进一步证实MdBBX51-His蛋白直接结合G-box，竞争性冷探针减弱结合，突变探针消除结合。
3.7 LUC和GUS验证MdBBX51激活MdCHS和MdDFR启动子：LUC报告基因检测显示，共表达MdBBX51和ProMdCHS-LUC或ProMdDFR-LUC显著增强荧光信号，表明MdBBX51正向调控这两个启动子。GUS染色和定量分析同样证明MdBBX51激活ProMdCHS-GUS和ProMdDFR-GUS表达。
3.8 MdBBX51结合MdMYB9启动子激活表达：分析七个ALA响应转录因子基因启动子，发现MdMYB9、MdMYB110a、MdbHLH3、MdWRKY71、MdTTG1、MdHsfB3a、MdERF78均含G-box。Y1H和EMSA显示MdBBX51仅结合MdMYB9启动子，不结合其他。LUC和GUS实验证实MdBBX51显著增强ProMdMYB9-LUC荧光信号和ProMdMYB9-GUS染色强度，证明其激活MdMYB9转录。
在讨论部分，研究人员总结了ALA诱导花青素积累的复杂调控网络，指出之前已鉴定的多个转录因子（如MdMADS1、MdERF78、MdMYB110a、MdNAC33、MdWRKY71等）参与其中，但BBX蛋白的参与鲜有报道。本研究首次阐明MdBBX51作为ALA响应的正调控因子，通过两种方式发挥作用：一是直接结合结构基因MdCHS和MdDFR启动子直接促进花青素生物合成；二是结合MdMYB9启动子激活其表达，MdMYB9进一步上调转运基因MdMATE8，从而间接促进花青素积累。此外，Y2H和LCI实验发现MdBBX51与光信号核心因子MdHY5存在蛋白互作，暗示其可能通过MBW复合体参与更广泛的调控。研究结论翻译如下：综合来看，本研究的成果支撑了一个工作模型，其中MdBBX51作为关键转录因子，通过结合MdCHS和MdDFR启动子直接促进花青素生物合成，或结合MdMYB9启动子间接促进花青素积累（通过上调MdMATE8基因），从而介导ALA诱导的花青素积累（图9）。该模型推进了对ALA诱导色素沉着分子机制的理解，并突出了MdBBX51调控模块的重要作用。
