整合多组学分析揭示UV-C（短波紫外线）辐照联合抗坏血酸超声雾化处理下鲜切苹果抗褐变的分子机制

《Scientia Horticulturae》：Integrated multi-omics analysis provides molecular insights into anti-browning in fresh-cut apples under UV-C irradiation combined with ultrasonic atomization of ascorbic acid treatment

　　

表面褐变是影响货架期内鲜切苹果品质的重要因素。本研究考察了UV-C（短波紫外线）联合抗坏血酸（AsA）雾化熏蒸处理（CT）对冷藏期间褐变发展的影响。结果表明，CT处理在贮藏第1天和第2天显著降低了褐变指数、a值、b值、O2·-、H2O2、丙二醛（MDA）、总酚、类黄酮、多酚氧化酶（PPO）活性和过氧化物酶（POD）活性，同时提高了L*值和还原型谷胱甘肽（GSH）含量。整合转录组和代谢组分析揭示，CT处理通过调控钙（Ca2+）和丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路，从而影响苯丙烷类生物合成、类黄酮生物合成、谷胱甘肽（GSH）代谢以及与酶促褐变反应相关的基因，抑制了鲜切苹果的褐变。推测的调控网络显示MdCNGCs、MdCMLs、MdCIPK、MdCaMRLK、MdPP2C、MdMAPKs、MdNACs、MdERFs、MdMYBs和MdbHLHs是这些代谢的关键调控因子。此外，分子对接暗示CIPK14-like和MAPKKK与NAC173相互作用并结合特定氨基酸残基，进一步推测NAC173在CT缓解鲜切苹果褐变中发挥关键作用。这些结果在转录和代谢水平上为CT缓解贮藏期间鲜切苹果褐变提供了新见解。但应注意，本研究的结论基于短期（2天）贮藏试验，CT处理在延长鲜切产品货架期方面的实际应用潜力仍需进一步长期研究验证。

该研究论文发表于《Scientia Horticulturae》（园艺科学）。研究背景方面，鲜切苹果因其便利性和独特风味日益受到消费者青睐，但切割伤口诱导的酶促褐变是限制其货架期和商业接受度的主要因素。现有褐变抑制策略如草酸、吡哆醇、L-半胱氨酸、熊果酸、硫化氢等虽有一定效果，但成本与安全性问题限制了实际生产应用。UV-C（短波紫外线）辐照作为低成本、环境友好的物理方法可有效调控次生代谢产物和生物抗氧化活性，抑制微生物生长与品质劣变；抗坏血酸（AsA）超声雾化可实现均匀涂覆并抑制褐变，但二者联合处理调控鲜切苹果褐变的分子机制尚不明确。因此研究人员开展此项研究，通过整合多组学（转录组学与代谢组学）分析，阐明UV-C联合AsA超声雾化处理抑制鲜切苹果褐变的分子调控机制，为绿色保鲜技术应用提供理论依据。研究得出以下结论：CT处理在短期（2天）冷藏中显著抑制褐变指数及相关生理指标恶化，其分子机制主要通过调控Ca²⁺信号与MAPK信号通路，影响下游苯丙烷类生物合成、类黄酮生物合成、GSH代谢及酶促褐变相关结构基因表达，其中转录因子NAC173等关键因子通过与CIPK14-like、MAPKKK蛋白形成氢键互作参与调控；该成果在转录和代谢水平揭示了CT抗褐变机理，但需长期试验验证实际应用潜力。研究意义在于为鲜切果蔬绿色保鲜提供了分子层面的理论支撑与关键候选基因、代谢枢纽信息。

关键技术方法包括：样本取自中国新疆乌鲁木齐当地超市购买的商业栽培苹果（Malus domestica），设置CT组（UV-C辐照2.1±0.1 mW cm^-2、峰值254 nm、7分钟，联合1% AsA超声雾化3分钟）与CK对照组，4℃、RH 85–90%贮藏2天并在第0、1、2天采样；品质与生理生化指标测定采用色差仪、理化试剂盒等；转录组学分析对第1天样本进行Illumina RNA-Seq建库测序，用DESeq2/EdgeR筛选差异表达基因（DEGs，|log2FC|>1，Q≤0.05）并做KEGG富集；代谢组学分析对第1天样本进行UPLC-ESI-MS/MS检测，筛选差异积累代谢物（DAMs，P<0.05，VIP>1）与KEGG注释；整合调控网络通过Pearson相关性（PCC）构建Ca²⁺/MAPK信号基因-转录因子-结构基因-代谢物共表达网络并用Cytoscape可视化；实时荧光定量PCR（qRT-PCR）验证转录组结果；分子对接采用Swiss-Model建模与HDOCK服务器预测蛋白-蛋白互作，PyMOL分析界面残基贡献。

研究结果如下：

3.1. CT treatment suppressed browning of fresh-cut apple fruit during storage（CT处理抑制贮藏期间鲜切苹果褐变）：研究人员通过观测褐变症状与测定色差参数发现，CT处理显著降低了整个贮藏期的褐变指数（BI）、a值、b值，提高了L值；贮藏第2天CT组BI、a、b分别较对照降低18.46%、36.46%、12.71%，L提高2.86%，且CT对硬度和可溶性固物/可滴定酸（TSS/TA）无显著影响，说明CT特异性靶向抑制褐变而非广泛影响基础品质。

3.2. CT treatment modulated ROS production and enzymatic browning-associated indexes in fresh-cut apple fruit（CT处理调节鲜切苹果ROS生成与酶促褐变关联指标）：研究人员测定活性氧（ROS）与膜脂过氧化及酶活指标发现，CT组O₂^·-、H₂O₂、丙二醛（MDA）含量在整个贮藏期维持更低水平，第2天时分别较对照降低25.52%、18.06%、19.16%；GSH（还原型谷胱甘肽）含量下降趋缓且高于对照，总酚、类黄酮含量升高趋势被抑制，PPO和POD活性持续上升但CT显著抑制此升高，第2天PPO、POD分别较对照低31.92%、41.88%；表明CT通过抑制膜脂过氧化、下调总酚与类黄酮底物水平及PPO/POD活性来缓解褐变。

3.3. Transcriptomics analysis in CT-alleviated browning of fresh-cut apples（CT缓解鲜切苹果褐变的转录组学分析）：研究人员对第1天样本进行RNA-Seq，获得高质量干净读长（Q20>99.15%，Q30>97.33%），CK vs CT比较鉴定出880个DEGs（372上调、507下调）；KEGG富集显示DEGs主要富集于植物MAPK信号通路、苯丙烷类生物合成、类黄酮生物合成、GSH代谢、植物-病原互作、植物激素信号转导通路；差异转录因子（TFs）涉及18个家族，其中NAC、ERF、MYB、bHLH、WRKY为最主要差异TF家族，提示这些通路与TFs在CT抗褐变中起关键作用。

3.4. Metabolomic profiles in CT-mitigated browning of fresh-cut apples（CT缓解鲜切苹果褐变的代谢组学分析）：研究人员基于UPLC-ESI-MS/MS在第1天鉴定出1424种代谢物，分8大类；CK-1 d vs CT-1 d筛选出48个差异积累代谢物（DAMs，26上调、22下调）；K-means聚类分为4簇（C1、C3为CT低于CK，C2、C4为CT高于CK）；DEGs与DAMs共富集分析主要聚焦于苯丙烷类生物合成与类黄酮生物合成途径，表明这些代谢通路是CT抑制褐变的核心代谢层面机制。

3.5. The differentially expressed profiles of TFs, Ca²⁺signaling, MAPK signaling, glutathione metabolism, and secondary metabolism（转录因子、Ca²⁺信号、MAPK信号、GSH代谢及次生代谢的差异表达谱）：研究人员针对关键通路的DEGs做热图分析发现，CT调控多个Ca²⁺信号基因（如MdCNGC10、MdCML19/23/45上调，MdCNGC1/4、MdGLR2.8、MdCIPK14-like、MdPP2C系列、MdMAPKKK系列等下调）；MAPK信号相关基因多被CT下调；差异TFs共67个（18家族，NAC 12个、ERF 10个、MYB 9个、bHLH 6个、WRKY 5个等）；次生代谢相关DEGs中苯丙烷类/类黄酮结构基因如Md4CL6、MdCCR1、MdCOMT1、MdCAD、MdLAC15、MdUFGT2等上调，MdF3′5′H、Md4CL2、MdCCoAOMT、部分MdUGTs等下调；GSH代谢相关MdGSTs（8个）、MdTRX上调，MdGGTs下调；酶促褐变相关MdRBOHD、MdPPOs、MdPODs、MdLipase等显著被CT下调。

3.6. The regulatory networks underlying CT-mitigated browning of fresh-cut apple fruit（CT缓解鲜切苹果褐变背后的调控网络）：研究人员通过Pearson相关（|PCC|>0.95等阈值）构建共表达网络发现，Ca²⁺信号（11 DEGs）和MAPK信号（8 DEGs）与40个TFs（MYB、NAC、ERF、bHLH、WRKY等）强相关；这些TFs进一步与14个结构基因（7个MdGSTs、2个MdPPOs、2个MdLipase、1个MdTRX、1个MdGGT、1个MdRBOHD，|PCC|>0.92）强相关；再与次生代谢结构基因（13个，如MdUGTs、Md4CLs、MdCCR1、MdCOMT1、MdCAD、MdLAC15等，|PCC|>0.90）强相关，并与10个次生代谢DAMs（如木犀草素-7-(6″-芹菜糖苷)、芥子醛、橄榄醇、阿魏酸、山奈酚、莽草酸等，|PCC|>0.8）强相关；整合网络表明Ca²⁺/MAPK信号-TFs-结构基因-代谢物级联调控CT抗褐变过程。

3.7. The verification of RNA-Seq data（RNA-Seq数据验证）：研究人员随机选取12个DEGs进行qRT-PCR验证，RNA-Seq与qRT-PCR结果呈强相关（R²=0.7958），证实转录组数据的可靠性。

3.8. Molecular docking analysis（分子对接分析）：研究人员因NAC为最大差异TF家族且NAC173（LOC103446368）与Ca²⁺/MAPK信号及褐变结构基因密切相关，对MdNAC173分别与MdCIPK14-like、MdMAPKKK做蛋白-蛋白对接；结果显示MdNAC173-MdCIPK14-like间形成多个氢键（如Tyr266-Arg235 2.8 ?、Arg72-Asp52等），MdNAC173-MdMAPKKK间也形成多个氢键（如Glu285-Arg317 2.7 ?、Asn284-Arg317 2.7 ?、Ile16-Tyr409 2.7 ?等），表明MdNAC173可与这两类信号蛋白稳定互作，可能在CT抗褐变胁迫防御信号通路中起关键调控作用。

讨论部分总结：研究人员指出，CT联合处理较单独处理更有效抑制褐变且对硬度与TSS/TA无显著影响，这与既往UV-C联合酸类处理结论一致；CT还抑制微生物生长（前期工作证实），但效果基于2天短期试验。生理层面CT降低ROS、MDA、总酚、类黄酮、PPO/POD，提升GSH，与褐变指数下降吻合，机制类似UV-C或钙+AsA等其他处理报道。多组学显示DEGs富集于MAPK信号、苯丙烷类/类黄酮生物合成、GSH代谢等，DAMs与DEGs共富集于苯丙烷类/类黄酮途径，印证这些通路为核心。Ca²⁺信号（CNGCs、CMLs、CIPK等）与MAPK信号（PP2C、MAPKKK等）在CT下差异表达，且与多种TFs（NAC、ERF、MYB、bHLH、WRKY等）强共表达，提示Ca²⁺/MAPK作为上游信号与TFs互作调控下游代谢；GSH代谢结构基因（MdGSTs上调、MdGGTs下调）及酶促褐变基因（MdPPOs、MdRBOHD等下调）与TFs（含NAC173、MYB、WRKY等）强相关，分子对接证实NAC173与CIPK14-like、MAPKKK形成稳定氢键网络，表明NAC173是CT下游关键TF之一；次生代谢结构基因（Md4CLs、MdCCR1、MdCOMT1、MdUGTs等）与TFs及对应DAMs（芥子醛、阿魏酸、山奈酚等）强相关，说明Ca²⁺/MAPK-TFs-结构基因-代谢物级联调控苯丙烷类/类黄酮代谢，从而降低褐变底物水平。研究人员也指出Ca²⁺信号在鲜切苹果中观察到的是第1天响应，不同于某些研究中几小时内早期激活，需进一步研究早期动态；整体模型为CT→调控Ca²⁺与MAPK信号→影响NAC等TFs→调控GSH代谢、酶促褐变基因、苯丙烷类/类黄酮结构基因→改变代谢物水平→抑制褐变。结论部分翻译如下：

结论：UV-C联合AsA雾化熏蒸在贮藏第1天和第2天减轻了鲜切苹果褐变。此外，多组学分析与基因调控网络构建揭示，基于第1天的观察，CT缓解鲜切苹果褐变的中介通路包括Ca²⁺与MAPK信号转导、次生代谢生物合成、苯丙烷类与类黄酮、GSH代谢。再者，分子对接发现CIPK14-like、MAPKKK和NAC173作为CT缓解鲜切苹果褐变的关键调控因子发挥作用。根据上述结果，基于第1天和第2天的观察推测出了CT缓解鲜切苹果表面褐变的潜在调控模型。本研究结果为CT处理在短期（2天）贮藏期间控制鲜切产品褐变的应用提供了有用基础，而本工作识别的关键候选基因与代谢枢纽在未来仍待进一步研究。