利用光栅耦合干涉技术(Grating-Coupled Interferometry, GCI)进行GPCR的热力学分析及片段筛选

《SLAS Discovery》：Thermodynamic Profiling and Fragment Screening of GPCRs Using Grating-Coupled Interferometry

　　

摘要：G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors, GPCRs)是药物发现中最重要的靶点类别之一，然而由于生物学认知有限及表征相关的技术挑战，许多GPCR仍处于药理学探索不足的状态。在此，研究人员评估了光栅耦合干涉技术(grating-coupled interferometry, GCI)作为一种多功能光学生物传感器平台在GPCR研究中的应用。研究人员以人腺苷A2A受体(A2AR)为模型系统，证实GCI可提供与成熟Biacore表面等离子体共振(SPR)技术高度相关的优质动力学数据。在适当设置下，waveRAPID（重复增加时长分析物脉冲）进样方法能够从单浓度注射中快速可靠地测定结合动力学与亲和力。研究人员进一步结合WAVEdelta系统具备的快速变温能力，将该方法扩展至利用最少蛋白消耗量测定多种A2AR配体的热力学参数。最后，研究人员使用包含704个成员的片段库进行了动力学片段筛选，以鉴定特异性A2AR结合剂。随后应用纳米差示扫描荧光法(nano differential scanning fluorimetry, nanoDSF)确认所鉴定苗头化合物的结合。综上所述，本研究确立了基于GCI的分析平台可作为GPCR靶点动力学、热力学及基于片段发现的有力且信息丰富的研究手段，对早期药物发现具有重要价值。

论文解读：利用光栅耦合干涉技术(GCI)进行GPCR的热力学分析及片段筛选

研究背景与意义

G蛋白偶联受体(GPCRs)是约30%已上市药物的靶点，但大量GPCR因内源性配体未知、信号通路复杂及技术瓶颈仍处于“孤儿受体”状态。传统的高通量筛选(HTS)依赖细胞功能或高亲和探针，难以适用于早期、难表征的GPCR。基于片段的药物发现(FBDD)虽为有力策略，但GPCR需依托去垢剂或纳米盘稳定，在表面等离子共振(SPR)等表面技术中易产生去垢剂吸附、变性蛋白非特异结合等背景噪音。光栅耦合干涉技术(Grating-Coupled Interferometry, GCI)是新兴的光学生物传感平台，其waveRAPID模式可通过单次短脉冲进样解析动力学，尤其适合易降解膜蛋白。本研究以人腺苷A_2A受体(A_2AR)为模型，系统评估GCI在GPCR动力学、热力学及片段筛选中的性能，论文发表于《SLAS Discovery》。

主要关键技术方法

研究人员选用昆虫细胞(Sf21)表达、经FLAG亲和及尺寸排阻色谱纯化的A_2AR作为主靶点，并以另一类A GPCR作为脱靶对照。核心生物物理平台为Creoptix WAVEdelta（GCI）及Biacore T200（SPR），芯片采用4PCP-NTA或NiHC1500M通过组氨酸标签捕获受体。关键技术包括：1) 多循环动力学(MCK)与单循环动力学(SCK)对照；2) waveRAPID单浓度短脉冲注入法（侧重解离相拟合）；3) 跨温区(4–32°C)快速变温测定，通过范特霍夫图(Van’t Hoff plot)求算焓(ΔH°)、熵(TΔS°)；4) 704成员片段库的单浓度高通量筛选，结合脱靶通道与双参考校正进行苗头化合物(hit)调用；5) 多循环动力学复测及纳米差示扫描荧光(nanoDSF)作为正交验证。

研究结果

3.1 蛋白制备

研究人员通过昆虫细胞表达系统获得约1–2 mg/L的A_2AR融合蛋白，经LMNG/CHS去垢剂提取、FLAG亲和及Superdex 200 Increase凝胶过滤，获得单体高纯度样品，浓缩至0.5–1 mg/mL供后续实验。

3.2 A_2AR结合 assay在Creoptix WAVEdelta上的开发

研究人员在GCI平台上以多循环动力学(MCK)模式测试了一系列工具化合物（拮抗剂、激动剂及类片段分子）。结果显示，GCI测得的结合动力学(k_on, k_off)及平衡解离常数(K_D)与Biacore SPR数据高度吻合，也与文献值一致。即便是低分子量化合物（如theophylline）也能获得清晰传感图；其中theophylline因过快动力学改用稳态平衡分析。waveRAPID单浓度模式对ANR94、LUF5834等化合物的测定结果与MCK一致，验证了该模式在GPCR上的可靠性。

3.3 利用waveRAPID进行热力学研究

研究人员选取SCH58261、KW3902、ANR94、LUF5834及PSB0777，在4–32°C范围内用waveRAPID单浓度注射，通过不同温度下的K_D构建线性范特霍夫图（无热容ΔC_p°修正）。结果表明：SCH58261和ANR94为焓驱动(ΔH°<0, ΔS°>0)；KW3902、PSB0777为熵驱动(ΔH°>0, ΔS°<0)；LUF0777与LUF5834为焓熵共同贡献。动力学分布图显示，KW3902、LUF5834的k_on与k_off随温度升高同步增加，沿等亲和力线移动，亲和力微降；而SCH58261及ANR94的k_off增速远超k_on，导致亲和力下降达50倍。这证明不同配体-蛋白相互作用的温度敏感性存在本质差异。

3.4 动力学片段筛选

研究人员优化为每孔5 s进样/15 s解离的高通量waveRAPID模式，每日筛选352个片段（50 μM单浓度）。以每32周期注入10 μM ANR94为正对照，芯片表面在16小时内保持稳定。对704个片段的初筛结果以动力学图(k_on-k_off)展示，等亲和力对角线辅助评估。命中标准设定为：R_max>1 pg/mm2、k_on>10? M?1s?1、拟合误差<75%、K_D<50 μM，并结合脱靶通道特异性目视检查。初筛得到16个苗头化合物（命中率~2.3%）。后续以MCK八点稀释复测，12个在稳态下确认为A_2AR结合剂，其中6个对脱靶GPCR无显著结合。稳态K_D为2.2–43 μM，与初筛waveRAPID估算值基本相符。研究人员进一步用nanoDSF正交验证，片段5、6使A_2AR熔解温度(T_m)分别偏移+1.01°C与+2.48°C且保留典型解折叠曲线，与结合事件一致；片段1–3虽稳定>3.5°C但改变解折叠形貌，片段4轻微去稳定，体现了nanoDSF的互补判断价值。

讨论与结论总结

研究人员讨论指出，GCI技术与经典SPR在GPCR工具化合物上高度相关，但GCI的waveRAPID模式更依赖解离相，可减轻GPCR体系中常见的去垢剂及非特异背景。快速变温的WAVEdelta使微量蛋白的热力学表征成为可能，弥补了等温滴定量热(ITC)对膜蛋白用量要求高的短板。动力学驱动的片段筛选引入早期脱靶对照，通过解离特征区分特异结合与介质干扰，提升了FBDD在GPCR上的信噪比与特异性。

结论部分翻译总结：本研究表明，光栅耦合干涉技术(GCI)是一个多功能、信息丰富的GPCR研究工具，为动力学、热力学及基于片段的发现提供了统一平台。将其整合至Evotec的发现流程中，可拓展机制研究与苗头化合物鉴定的分析工具箱，推动以结合动力学为驱动的GPCR早期理性药物发现。