一种基于比色法的纳米酶传感器阵列，用于准确区分柑橘网纹果（Citri reticulatae）果皮的地理来源和储存时间

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：A colorimetric nanozyme sensor array for authentic discrimination of geographical origin and storage age of Citri reticulatae pericarpium

　　

施凯汉|孟天|侯玉晨|张子涵|赵蕾|刘伟|赵宇

吉林人参学院，长春中医药大学，中国长春130017

摘要

橘皮，学名为Citri reticulatae pericarpium（CRP），是一种被广泛记录的具有药用和食品价值的材料。由于其多样的性质和已证实的生物活性，CRP在全球范围内受到了广泛关注。然而，CRP的价格和药理活性会因其地理来源和储存时间而显著不同。因此，开发一种快速简便的CRP鉴别方法至关重要。在本研究中，通过温和的蚀刻技术成功制备了一种具有优异漆酶样（LAC）和过氧化物酶样（POD）活性的Cu@ZIF-67纳米酶。酶活性测定表明，在Cu²⁺浓度为175?mM时，该纳米酶的双酶活性达到最佳。利用TMB、4-AP和2,4-DP催化氧化产生的不同波长信号（370?nm、652?nm和504?nm），构建了一个多波长三通道传感阵列。机制研究表明，CRP中存在的五种黄酮类化合物对TMB氧化具有竞争性抑制作用，而对4-AP和2,4-DP的氧化则表现为非竞争性抑制。这种差异导致了过氧化物酶样通道和漆酶样通道之间的抑制效果存在显著差异。通过整合线性判别分析（LDA），实现了对这五种黄酮类化合物的精确定性鉴别。此外，还建立了一个基于K-最近邻（KNN）算法的浓度无关模型，能够准确鉴别来自8个省份21个城市的CRP样品，并可靠地区分不同储存时间的样品。因此，这种基于比色传感阵列的策略为CRP的鉴别提供了一种快速且低成本的工具，确保了其质量控制。

引言

Citri reticulatae pericarpium（CRP）来源于中国Citrus reticulata Blanco及其栽培品种的干燥成熟果皮。CRP富含多种生物活性成分，包括黄酮类、挥发油、柠檬苷、生物碱和果胶多糖[1]、[2]。现代药理学研究表明，它具有多种生物活性，如抗氧化、抗菌、祛痰、平喘作用，以及降压、抗中风和抗血栓形成特性[3]、[4]，使其成为医药和食品应用中备受重视的双重用途成分。CRP中的活性成分受其来源和储存时间的影响。CRP的主要栽培品种分为两类：Citrus reticulata ‘Chachi’（CRC），起源于广东省新会区；以及Citrus reticulata Blanco（CRB），在其他地区栽培[5]。其中，CRC因其更佳的香气和增强的药理特性而最为著名[6]。CRP的价值随时间增长而提高，有“越陈越香”甚至“百年CRP比黄金更珍贵”的说法[7]。仅凭外观、气味或味道很难区分来自不同地理来源和储存时间的CRP。因此，市场上经常出现以次品冒充优质产品的欺诈行为。例如，不法商贩可能将CRB误标为更昂贵的CRC，或将较新的CRP标示为更老的。因此，基于储存时间准确鉴别CRP至关重要。

目前，已有许多方法用于识别CRP的地理来源和储存时间[8]、[9]、[10]、[11]。这些技术包括高效液相色谱（HPLC）、气相色谱-质谱（GC–MS）、红外光谱和光谱传感技术。与仪器分析方法相比，光谱传感技术具有快速、准确和成本效益高的优势。特别是统计建模技术的应用为CRP的鉴别开辟了新的方向。例如，Lan等人开发了一种基于Al³⁺和BSA/TSA-AgNCs的视觉荧光传感方法，实现了无需仪器的快速准确检测[12]。

传感阵列技术可以从分析物生成独特的多维指纹；然后通过机器学习分析实现高效鉴别。该技术已广泛应用于区分茶叶品种、识别药品和食品材料的假冒品，以及检测和区分重金属离子[13]、[14]、[15]、[16]。因此，对于成分相似的中药，传感阵列在鉴别中的应用具有巨大潜力。在之前的研究中，我们的研究小组构建了一个三通道荧光传感阵列[17]。利用决策树（DT）算法建立的浓度无关鉴别模型，我们成功识别了来自四个不同地理来源的Asarum样品。

虽然已经使用多种纳米材料构建了基于纳米酶的传感阵列，但大多数现有系统需要合成具有不同功能的多种纳米材料作为识别探针，这增加了实验的复杂性和成本[18]、[19]、[20]、[21]。因此，基于单一纳米材料开发多通道传感阵列尤为重要。具有内在多酶样活性的纳米材料的出现为克服这些限制提供了有效策略[22]、[23]。沸石咪唑框架（ZIFs）因其高孔隙率、较大的比表面积和结构可调性而在催化领域引起了广泛关注[24]。为了提高ZIFs对特定底物的传输效率，研究人员积极调整了ZIF通道的孔径、形态和化学功能化[25]、[26]、[27]、[28]。例如，Sun等人通过调节Co²⁺与有机配体2-甲基咪唑的前体比例，成功制备了ZIF-67纳米花。这种材料首次表现出显著的过氧化物酶（OXD）样活性[29]。

在本研究中，我们开发了一种新型纳米酶（Cu@ZIF-67），并将其作为单一探针构建了一个三通道比色传感阵列。Cu@ZIF-67表现出显著的双酶样活性。其在H₂O₂存在下催化无色TMB氧化为蓝色ox-TMB，显示出370和652?nm处的特征吸收峰，证实了其过氧化物酶样（POD样）活性；同时，它还催化了4-氨基酚（4-AP）和2,4-二氯酚（2,4-DP）的氧化，相应产物在504?nm处显示出吸收峰。这些波长的吸收强度取决于不同黄酮类化合物的还原能力，从而为每种分析物提供了独特的光谱特征。基于这一原理，所开发的三通道比色传感阵列成功区分了五种单独的黄酮类化合物及其混合物。此外，它还能可靠地区分CRP样品的地理来源和储存时间（图1）。值得注意的是，这是首次应用传感阵列技术同时区分CRP的地理来源和储存时间，为确保其质量评估提供了一种新颖可靠的方法。

章节片段

化学物质和仪器

本研究中使用的化学物质和仪器的详细信息见支持信息。

Cu@ZIF-67的制备

ZIF-67的合成基于参考方法并进行了轻微修改[30]。首先，使用2?mg的CTAB作为模板，并与0.292?g的Co(NO₃)₂·6H₂O一起分散在10?mL去离子水中，称为溶液A。同时，将4.54?g的2-MI溶解在70?mL去离子水中，称为溶液B。随后，将溶液A连续加入

Cu@ZIF-67的特性研究

为了优化Cu@ZIF-67的催化性能，我们进一步研究了Cu²⁺掺杂量对其酶样活性的影响。在ZIF-67的量保持不变的情况下，通过改变Cu(NO₃)₂·3H₂O的浓度来调整Cu²⁺的含量，具体为25、75、125、175和225?mM。如图S1所示，Cu²⁺的掺入显著增强了Cu@ZIF-67的LAC样和POD样活性。当Cu²⁺浓度为175?mM时，这两种活性达到最大值

结论

在本研究中，通过将Cu²⁺负载到ZIF-67纳米框架上，制备了一种新型纳米酶Cu@ZIF-67，其在Cu²⁺掺杂浓度为175?mM时表现出最佳的POD样和LAC样活性。这种纳米酶同时具有POD样和LAC样活性。动力学分析表明，黄酮类化合物对TMB氧化具有竞争性抑制作用，但对4-AP/2,4-DP系统则表现为非竞争性可逆抑制。这些不同的抑制机制

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了中国吉林省科学技术发展计划（项目编号：YDZJ202501ZYTS680）的支持。