使用选择性荧光探针可视化重金属和盐胁迫下作物根系中硫化氢的动态变化

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Visualizing hydrogen sulfide dynamics in crop roots under heavy metal and salt stress using a selective fluorescent probe

　　

杨张|赛志鹏|王华宇|刘增新|杨艳|葛春波

河南医科大学基础医学院法医学系，新乡453003，中国

摘要

硫化氢（H?S）是一种气体信号分子，在许多生理和病理过程中发挥着关键作用，包括植物的应激反应。在复杂的生物和植物系统中，仍迫切需要有效的荧光探针来可视化H?S。在这项工作中，我们使用4-硝基苯并呋喃唑作为识别基团，构建了一种新型荧光探针ZT。当与H?S通过亲核取代反应时，该探针会显示出典型的开-关荧光响应。ZT具有优异的传感性能，包括高抗干扰能力、超高的灵敏度（LOD = 34 nM）和良好的生物相容性，这使得能够在复杂的生物环境中可靠地检测微量H?S。该探针能够在洋葱表皮细胞、斑马鱼幼体和哺乳动物活细胞中实现内源性H?S的实时原位成像。此外，它还被用于监测暴露于重金属和盐胁迫下的小麦幼苗中的H?S动态。这项工作提供了一种高性能的H?S荧光探针，具有广泛的应用前景，并为研究H?S在植物非生物胁迫抗性中的调控机制提供了新的线索。

引言

硫化氢（H?S）是生物体内一种重要的内源性气体信号分子。它在植物和动物的生理代谢和应激反应中起着关键的调控作用[1]、[2]、[3]、[4]、[5]。在植物中，H?S参与多种过程，包括种子萌发、器官发育、代谢过程以及对各种非生物胁迫（如重金属暴露（例如Cd²⁺和Cr³⁺）和盐胁迫[6]、[7]、[8]、[9]、[10]）的响应。通过调节氧化还原平衡、应激相关基因表达和离子运输，H?S显著增强了作物的抗逆性，确立了其作为植物适应不良环境信号分子的重要作用[11]、[12]。在动物中，H?S参与多种生理过程，包括炎症反应、心血管功能调节和神经保护[13]、[14]、[15]、[16]。H?S代谢的失调与包括心血管和神经系统疾病在内的多种疾病的发病和发展有关。

由于其固有的性质，如高挥发性、体内低浓度（从纳摩尔到微摩尔）和短半衰期，传统的检测方法（如气相色谱和电化学技术）复杂、耗时，并且无法在生物体内进行实时监测[17]、[18]、[19]。因此，开发适用于多种生物系统的高选择性、高灵敏度和生物相容性的H?S检测工具已成为氧化还原生物学、农业胁迫生理学和生物医学领域的重要研究重点。

目前传统的H?S检测方法，如电极技术、亚甲蓝测定法和色谱法，具有较高的检测精度[21]、[22]、[23]。然而，这些方法通常需要昂贵的精密仪器，并涉及复杂的操作程序。它们还容易受到温度、湿度和pH等环境因素的干扰。生物样本分析通常需要在检测过程中进行预处理，这可能会对样本造成不可逆的损伤。这严重限制了这些方法在活植物样本和复杂生物系统中的实际应用。相比之下，荧光分析技术因其高灵敏度、快速响应时间、简单性、非侵入性和实时成像能力而受到广泛关注。它已广泛应用于基础科学研究、生物医学诊断和环境监测等领域[24]、[25]、[26]、[27]、[28]。近年来，研究人员利用各种荧光骨架开发了许多H?S荧光探针来解决H?S检测的挑战。其中最常用的荧光团包括香豆素[29]、[30]、硼二吡咯（BODIPY）[31]、[32]、[33]、1,8-萘酰亚胺[34]、[35]、罗丹明[36]、咔唑[37]和荧光素[39]。然而，许多报道的H?S荧光探针仍然存在显著的限制。一些探针的选择性较差，容易受到活性氧（ROS）、活性硫物种（RSS）和内源性氨基酸[40]、[41]的干扰。此外，某些探针的生物相容性有限且具有显著的细胞毒性，不适合长时间体内成像。因此，它们无法用于复杂植物样本的精确成像和分析[42]。

为了解决现有探针在实际应用中的局限性，本研究报道了一种新型H?S荧光探针ZT的设计和合成。ZT探针使用4-硝基苯并呋喃唑（NBD）作为特异性识别单元[43]，通过H?S引发的亲核取代反应实现高度选择性和精确的响应，有效减少了其他生物分子的干扰。实验证据表明，ZT探针表现出出色的选择性、高灵敏度和良好的生物相容性以及低检测限，满足了在复杂生物环境中准确检测H?S的严格要求。利用ZT探针，我们成功实现了洋葱表皮细胞、斑马鱼幼体和哺乳动物细胞中内源性H?S波动的实时可视化和动态监测。此外，ZT的应用范围扩展到了小麦幼苗系统，有助于系统分析在常见非生物胁迫条件（包括Cd²⁺、Cr³⁺和盐胁迫）下的H?S动态。这些发现提供了新的实验证据，有助于更好地阐明H?S在植物生长、发育过程和应激适应中的调控作用。总之，本研究成功开发了一种高性能、多功能H?S荧光探针，为推进体内植物成像技术和农业抗逆性研究提供了可靠的化学工具和方法论框架。这项工作具有重要的理论意义，并具有广泛的应用潜力。

章节片段

仪器和化学品

本研究中使用的所有试剂均为分析级或光谱级，购自商业供应商，包括Bidepharm和Energy Chemical。小麦种子来自在线供应商“You Nong Tao Dou”。UV–vis吸收光谱使用Shimadzu UV-2600 UV–可见分光光度计记录。荧光光谱使用Hitachi F-4700荧光分光光度计收集。¹H NMR和¹³C NMR光谱使用Bruker AVANCE NEO 400 MHz记录

ZT探针的设计与合成

ZT探针的设计采用了香豆素-哌嗪骨架作为荧光团，4-硝基苯并呋喃唑（NBD）作为特异性硫化氢（H?S）识别基团。在没有H?S的情况下，NBD基团通过光诱导电子转移（PET）过程有效淬灭香豆素荧光团的固有荧光，导致探针的荧光发射较弱。当暴露于H?S时，亲核HS^?离子选择性地与CN键

结论

在这项研究中，我们设计并合成了一种高选择性的荧光探针，该探针结合了香豆素-哌嗪荧光团和4-硝基苯并呋喃H?S特异性识别基团。该探针表现出优异的光物理性质，如低检测限（34 nM）、高光稳定性以及可靠的性能。我们进一步验证了其在多个系统中的生物相容性和应用潜力，包括活细胞、斑马鱼模型和植物系统。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了河南省自然科学基金（252300423182、252300421393）和河南省学生创新创业培训计划（资助编号S202510472031）的资助。