利用掺锰氧化铈纳米酶进行的酪氨酸酶活性的显色检测方法

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：A turn-on colorimetric detection of tyrosinase activity with manganese-doped cerium oxide nanozyme

　　

朱玉迪|傅宇|涂一峰|马琦|严吉林

中国苏州大学化学、化学工程与材料科学学院健康化学与分子诊断重点实验室，仁爱路199号，215123

摘要

我们开发了一种针对酪氨酸酶活性的灵敏比色检测方法。通过简单的水热工艺合成了棒状掺锰氧化铈（Mn/CeO₂）纳米酶。这种纳米复合材料表现出类似过氧化物酶的活性，能够有效加速无色显色底物TMB（3,3′,5,5′-四甲基联苯胺）转化为蓝色产物的过程。研究发现，酪氨酸酶的底物儿茶酚显著抑制了这一催化反应及随后的颜色变化。进一步加入酪氨酸酶后，儿茶酚被氧化为苯醌产物，从而消除了抑制作用并恢复了纳米酶的催化活性。该方法对酪氨酸酶的检测灵敏度范围为1–3000 U/L，检测限为0.3 U/L。此外，该方法已成功应用于实际样品的分析。

引言

酪氨酸酶（TYR）是一种含铜的氧化还原酶，在生态系统（包括动物组织、植物和微生物）中广泛存在[1]、[2]。该酶负责催化单酚类物质氧化为邻二酚类物质（如儿茶酚），进而进一步氧化为相应的苯醌类物质[3]、[4]。在黑色素生物合成过程中，酪氨酸酶的催化作用至关重要，因为黑色素是哺乳动物毛发和皮肤中的主要色素[5]、[6]。人体内酪氨酸酶水平异常偏低可能会扰乱黑色素代谢，可能导致癫痫和白化病等疾病[7]、[8]；相反，酪氨酸酶水平过高则与帕金森病和皮肤癌风险增加有关[9]。鉴于其生物学重要性，酪氨酸酶的检测已成为生物学研究和临床诊断的重要课题。然而，由于实际样品中酪氨酸酶的含量较低，因此需要高灵敏度的检测方法。目前已开发出多种检测方法，包括电化学方法、荧光法、表面增强拉曼光谱（SERS）和比色法[10]、[11]、[12]、[13]。但这些方法大多需要昂贵的仪器和复杂的操作流程。另一个问题是检测灵敏度的问题：大多数检测信号直接来源于酪氨酸酶的催化过程（从底物到产物的转化），而实际样品中酪氨酸酶的含量通常较低，因此这些方法的灵敏度不足以满足需求。

在本研究中，我们开发了一种简单、低成本且有效的酪氨酸酶活性检测策略。通过简单的水热工艺合成了具有类似过氧化物酶（POD）活性的纳米催化剂。在儿茶酚（CC）存在下，纳米酶的POD活性受到抑制，导致催化效率降低；而当儿茶酚作为酪氨酸酶的底物时，其氧化反应得以进行，从而消除了抑制效应并恢复了纳米酶的POD活性。利用POD的显色底物，可以通过比色法定量检测酪氨酸酶的存在。与以往大多数方法相比，本方法引入了额外的放大机制，使得检测灵敏度显著提高，可检测低至0.3 U/L的酪氨酸酶浓度。此外，所有所需试剂价格低廉且易于获取，普通的光度计即可完成检测任务。这些因素使得酪氨酸酶的低成本检测成为可能。通过实际样品的分析，验证了该方法的实用可行性。

章节摘录

化学试剂

酪氨酸酶（来自Solarbio公司，中国）https://www.solarbio.com/；儿茶酚（CC）来自J&K Scientific公司（中国）https://www.jkchemical.com/；硫酸锰（MnSO₄和六水合硝酸铈（III）（Ce(NO₃)₃·6H₂O）来自Sinopharm Chemical Reagent公司（中国）https://www.sinoreagent.com/；TMB（3,3′,5,5′-四甲基联苯胺）来自上海Rhawn Chemicals公司（中国）https://www.rhawn.cn/；酪氨酸酶检测试剂盒（基于L-多巴光度法）也来自相关公司。

掺锰氧化铈（Mn/CeO₂）纳米棒及其过氧化物酶活性

为了满足分析过程中的灵敏度和低检测限要求，通常会采用信号放大技术[15]。对于低浓度分析物而言，这种放大尤为重要。一种常见的策略是引入能够持续产生信号的酶，例如常用的ELISA（酶联免疫吸附测定）[16]。分析过程中使用的酶（如辣根过氧化物酶（HRP））能够催化相关反应。

结论

本研究开发了一种简单有效的酪氨酸酶检测方法。酪氨酸酶的催化作用导致底物儿茶酚的氧化，进而显著调节了Mn/CeO₂纳米酶的POD样活性。该方法具有选择性、稳定性和重复性，低检测限使其能够应用于实际样品分析。

CRediT作者贡献声明

朱玉迪：概念设计、方法学研究、实验实施、初稿撰写及审稿编辑。傅宇：方法学研究、实验实施。涂一峰：概念设计。马琦：概念设计、撰写及审稿编辑。严吉林：概念设计、撰写及审稿编辑。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。