糖基化位置对黄酮类异构体抑制乳腺癌相关酶CYP1B1的作用影响

《Steroids》：Impact of glycosylation position on flavonoid isomers' inhibition of breast cancer-associated enzyme CYP1B1

　　

王一楠|郭琦|卢金月|田媛|孟欣

黑龙江中医药大学药学院，和平路24号，哈尔滨150040，中国

摘要

天然黄酮类化合物的异构性对其酶抑制活性有重要影响，尤其是对细胞色素P450酶的抑制作用。芒果苷（mangiferin）和异芒果苷（isomangiferin）是两种C-糖基黄酮异构体，它们仅在黄酮骨架的糖苷取代位置上有所不同，是研究其与CYP1B1（一种与乳腺癌相关的酶，参与致癌物质的活化）结构-活性关系的理想模型化合物。然而，这种糖苷位置异构性是否会影响CYP1B1的抑制作用和结合行为目前尚不清楚。本文通过酶动力学、量子化学计算、分子对接以及基于机器学习的ADMET预测方法，系统地研究了芒果苷和异芒果苷对CYP1B1的抑制作用及其分子机制。动力学分析表明，芒果苷对CYP1B1的抑制作用比异芒果苷强100多倍，并表现出混合型抑制作用，而异芒果苷则表现出非竞争性抑制模式。量子化学计算显示，糖苷位置的改变会改变HOMO-LUMO能量分布和电子密度，从而影响分子间相互作用。分子对接确定了芒果苷更强结合的关键残基。ADMET预测表明这两种化合物具有良好的药代动力学特性和较低的毒性。这些结果表明，糖苷取代位置的微小变化可以显著影响芒果苷和异芒果苷对CYP1B1的抑制效力和结合方式，为这类异构体的结构-活性关系提供了机制上的见解。

引言

乳腺癌是全球女性中最主要的恶性肿瘤之一，其癌症相关死亡率位居第二，每年发病率约为1%，尤其是在激素敏感型和早期病例中[1]。细胞色素P450 1B1（CYP1B1）是一种关键的代谢酶，通过参与内源性和外源性化合物的代谢，在乳腺癌的发生和发展中起重要作用[2]。此外，该酶还可能参与多种抗癌药物的代谢失活，从而导致治疗耐药性和肿瘤进展。已知的抑制剂2,4,3′,5′-四甲氧基芪（2,4,3′,5′-tetramethoxystilbene）对CYP1B1具有很强的纳米摩尔级抑制活性（IC₅₀ = 6 nM）和高选择性，这支持了CYP1B1作为药物靶点的可行性[3]。此外，CYP1B1对转录因子（如Sp1）的调节已被证实与上皮-间充质转化和Wnt/β-连环蛋白信号通路的激活有关，从而促进癌细胞的增殖和转移[4]，[5]。综上所述，这些发现使CYP1B1成为乳腺癌治疗的一个有前景的靶点，并为开发选择性CYP1B1抑制剂提供了有力依据。在CYP1B1靶向抑制剂的研发中，天然产物因其结构多样性、良好的生物相容性和相对较低的毒性而受到广泛关注[6]，[7]。许多天然化合物已被发现能抑制CYP1B1，例如黄酮类、多环芳烃、香豆素、蒽醌和生物碱[8]，[9]。特别是黄酮类化合物，由于其富含羟基的结构以及强大的抗氧化、抗炎和抗癌特性，显示出作为CYP1B1抑制剂的巨大潜力[10]，[11]，[12]。

芒果苷及其结构异构体异芒果苷（图1）是常见的C-糖基黄酮类化合物，广泛存在于各种传统药用植物中，并具有文献记载的抗氧化、抗炎和抗癌活性[13]，[14]，[15]。最近的研究表明，芒果苷可以通过PI3K/Akt和MAPK等途径调节关键细胞过程，从而抑制乳腺癌细胞的生长。异芒果苷在体内和体外模型中也表现出广泛的抗肿瘤活性，包括抑制乳腺癌细胞的迁移、侵袭、黏附和血管生成[16]，[17]。尽管这两种化合物具有相同的分子式，仅在糖苷连接位置上有所不同，但这种微妙的结构异构性可能导致分子构象、电子密度分布和与靶蛋白的结合行为发生显著变化，从而导致不同的抑制机制。

芒果苷及其C4-糖基异构体异芒果苷是天然存在的黄酮类化合物，具有多样的药理活性。药代动力学研究表明，芒果苷对CYP1A2的抑制作用不明显，且对其他CYP P450亚型的抑制风险较低，表明其可能具有选择性[18]。然而，在人类原代肝细胞模型中，250 μg/mL的芒果苷显著降低了多种药物代谢酶（包括CYP1A2、CYP2A6、CYP2C9、CYP2D6和CYP3A4）的活性，分别降低了约50%，同时使UGT1A1和UGT2B7的活性降低了约55%和35%，表明其在细胞系统中的代谢网络调节具有依赖性[19]。分子对接和分子动力学研究提供了芒果苷与蛋白质相互作用的结构见解。去质子化的芒果苷能够稳定地结合到丝氨酸羟甲基转移酶（SHMT）的四氢叶酸结合口袋中，结合能为?9.2 kcal/mol。此外，系统性的对接分析显示其与多种疼痛和炎症相关靶点存在相互作用，某些核心蛋白的结合能为?9.6 kcal/mol。网络药理学进一步确定了芒果苷的356个潜在靶点，而对接验证确认了其与AKT1和TNF等关键靶点的相互作用，结合能分别为?8.3 kcal/mol和?7.9 kcal/mol。这些研究为芒果苷的多靶点相互作用机制提供了结构上的假设[20]，[21]。

尽管对芒果苷和异芒果苷进行了大量的药理学研究，但它们与CYP1B1的直接相互作用仍大多未被探索。目前尚无关于其CYP1B1抑制活性、动力学行为或结构-活性关系的实验证据。虽然药代动力学研究表明芒果苷可能调节多种CYP亚型，但其对CYP1B1的选择性尚未明确。重要的是，糖基化位置（芒果苷中的C4位点与异芒果苷中的C2位点）对CYP1B1结合亲和力和抑制机制的影响仍不清楚。为了解决这些疑问，本研究系统地研究了芒果苷和异芒果苷对CYP1B1的抑制作用。研究假设芒果苷和异芒果苷之间糖基化位置的微小差异可能影响它们的分子空间构象、电子分布以及与CYP1B1活性位点的结合能力，从而调节它们的结合模式和抑制活性。为了验证这一假设，首先进行了重组CYP1B1酶的动力学测定，以确定这两种化合物的IC₅₀值和抑制动力学参数，从而获得基本的抑制特征。在此基础上，进一步利用量子化学计算分析了前沿分子轨道能量和电子密度分布。分子对接用于探讨它们与CYP1B1活性位点内关键氨基酸残基的相互作用。此外，还应用ADMET预测方法评估了它们的药物代谢和安全性相关特性。这些分析综合了电子结构、分子识别和药代动力学特征，多层面地阐明了糖基化位置对生物活性的影响。

章节片段

材料

芒果苷和7-乙氧基雷索酚（7-ER）购自中国上海的源业生物科技有限公司（Yuanye Biotech Co., Ltd.），异芒果苷购自中国成都的普思生物科技有限公司（Chengdu Pusi Biotechnology Co., Ltd.）。成都的西龙化学有限公司（Xilong Chemical Co., Ltd.）提供了六水合氯化镁、甲醇、磷酸盐缓冲液、去离子水和L-（+）-抗坏血酸。NADPH购自德国曼海姆的罗氏诊断公司（Roche Diagnostics GmbH）。重组人CYP1B1酶购自Discovery Labware。

黄酮类化合物对重组人CYP1B1蛋白的抑制作用

通过测量EROD羟基化过程中雷索酚的生成速率，确定了重组人CYP1B1的酶动力学参数。V_max和K_m值分别为16.25 ± 0.33 nM/min/pmol CYP1B1和0.12 ± 0.01 mM。如图3所示，IC₅₀值是基于S形剂量-反应曲线拟合计算得出的。结果表明，这两种化合物均能抑制CYP1B1的活性，其中芒果苷的抑制作用更强。

讨论

尽管芒果苷及其C4-糖基异构体异芒果苷在结构上相似，但它们在抑制乳腺癌相关酶CYP1B1方面存在显著差异。酶动力学分析显示，芒果苷对CYP1B1的抑制作用较强，IC₅₀为1.2 μM，比异芒果苷（IC₅₀ = 130 μM）低100多倍。芒果苷的酶动力学分析表明，在芒果苷存在的情况下，Vmax显著降低，而Km增加。

结论

芒果苷和异芒果苷具有高度相似的结构框架，主要区别在于糖基化位置。这种微妙的结构差异显著影响了它们与CYP1B1的结合亲和力和抑制效力。酶动力学分析表明，芒果苷表现出混合型抑制作用，既与游离的CYP1B1结合，也与酶-底物复合物结合；而异芒果苷则表现出非竞争性抑制模式，主要与CYP1B1的活性位点结合。

CRediT作者贡献声明

王一楠：撰写初稿、方法学设计、数据分析。郭琦：实验研究。卢金月：概念构思。田媛：资源获取。孟欣：撰写、审稿和资金申请。

意义声明

本研究揭示了糖基化位置对黄酮类化合物抑制乳腺癌相关酶CYP1B1活性的关键影响，芒果苷的抑制效力比异芒果苷高100多倍，为未来基于天然产物的乳腺癌干预研究提供了方向。

资助声明

本研究得到了黑龙江省自然科学基金（PL2024H208）的支持。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。