一种基于Tb（铽）-金属-有机凝胶的增强型电化学发光生物传感器，配备超三明治DNA行走器用于检测奥卡达酸

《Talanta》：A Tb-metal-organic gel enhanced electrochemiluminescence biosensor with a supersandwich DNA walker for okadaic acid detection

　　

施淑萍|张燕|杜宇|赵传胜|张楠|余臻|贾月|秦伟

中国山东省济南市济南大学化学与化学工程学院界面反应与传感分析重点实验室，邮编250022

摘要

奥卡迪酸（OA）是一种由海洋甲藻产生的强效腹泻性贝类毒素，会在贝类体内积累，并通过引发严重的胃肠道疾病对人类健康构成重大威胁。因此，高灵敏度地检测OA至关重要。在这项研究中，基于Tb(Ⅲ)-Cbatpy-MOGs复合物和核酸扩增策略，开发了一种用于检测OA的电化学发光（ECL）生物传感器。该传感器结合了循环DNA行走器，并利用外切核酸酶III的催化作用实现目标分子的精确定量。ECL强度与OA浓度的对数呈强线性关系，检测限低至0.16 pg/mL，证明了其高灵敏度。此外，该生物传感器还表现出优异的选择性、重复性和稳定性，证实了其在实际应用中的可靠性。这项工作为OA的检测提供了一种稳健且高灵敏度的方法，对海洋毒素的监测具有很大潜力。

引言

海洋生物毒素是一类多样的天然毒素，能够引发动物和人类的多种毒理反应[1]。这些毒素会在以浮游藻类为食的贝类体内积累或被其代谢[2]。奥卡迪酸（OA）通过刺激控制肠道细胞钠分泌的蛋白质的磷酸化，或增强调节溶质通透性的分子的磷酸化，最终导致大量体液流失[3,4]，从而引发腹泻。已经开发出了多种OA检测技术，每种技术在原理、性能和应用方面都有其独特优势。酶联免疫吸附测定（ELISA）通过酶介导的颜色反应提供了高通量分析的稳健平台[5]。时间分辨荧光免疫测定（TR-FIA）使用稀土标记的抗体，实现了更高的灵敏度和更宽的动态范围[6]。氧化石墨烯辅助的纸尖免疫传感器（GO-PTIS）利用智能手机可实现快速现场定量，检测限低至20 pg/mL[6]。相比之下，电化学发光（ECL）结合了电化学和光化学技术，具有高发光效率、简化光学设置和成本效益[7]。ECL是由电生成的自由基的化学反应产生的激发态产生的，无需外部光源，从而最大限度地减少了光学干扰[8,9]。这些特性使其具有接近零的背景噪声、高灵敏度和宽动态范围，使其成为不可或缺的生物分析技术[10]。此外，与一些传统方法相比，ECL在复杂基质中表现出更强的稳定性，为OA的快速和高灵敏度检测提供了有希望的途径[11]。

近年来，镧系金属有机凝胶（Ln-MOGs）作为一种新型多孔发光材料，由于其独特的天线效应和能量传递能力逐渐受到关注[12, [13], [14], [15]]。在典型的Ln-MOG系统中，有机配体吸收能量后，不是直接发射，而是通过配体到金属的能量传递（LMET）过程将激发态能量高效传递给镧系离子，从而产生具有大斯托克斯位移的窄带发射[15, [16], [17], [18], [19]]。研究表明，有效的LMET依赖于两个关键因素[20,21]。首先，镧系离子与有机配体之间的稳定配位结构至关重要，因为它确保了从配体到金属中心的最佳距离和轨道重叠，从而实现有效的能量传递。根据硬软酸碱理论，镧系离子（硬酸）与羧酸氧和吡啶氮供体（硬碱或边界碱）具有强烈的配位倾向，这有助于形成稳定的金属有机框架[13,22,23]。其次，有效抑制配体的非辐射松弛途径也很关键。Ln-MOGs的多孔网络对配体的分子内旋转和振动施加了显著的物理限制，从而将能量耗散最小化为热量或振动。因此，配体的激发态能量优先通过LMET途径传递给镧系离子，提高了发光效率。这些综合特性使Ln-MOGs成为高灵敏度ECL生物分析的理想平台[24,25]。

此外，DNA行走器循环扩增策略结合外切核酸酶III（Exo III）的辅助作用，是实现OA超灵敏检测的关键技术基础。该策略的核心原理在于通过目标触发特异性识别和酶催化的循环反应实现高效的信号探针富集和信号放大。这一策略具有三个关键优势：首先，通过循环反应实现高信号放大效率，cDNA被重复利用，每个目标分子可以触发多轮切割，从而在电极表面积累大量铁氰化物（Fc）标记的信号探针，显著增强ECL信号响应；其次，它具有很强的特异性，依赖于适配体（Apt）与OA之间的高度特异性结合以及Exo III的酶促特异性，有效避免了非特异性反应引起的背景干扰，确保了检测结果的准确性；第三，它具有快速和可控的响应特性。酶催化反应和DNA杂交的协同作用使得循环过程在温和条件下高效进行，目标识别和信号放大在30分钟内完成，满足了快速检测的需求。与传统的核酸扩增技术（如滚环扩增和链置换扩增）相比，这种DNA行走器策略无需复杂的引物设计或高温退火步骤，只需温和的反应条件和简单的操作。同时，通过调节DNA链序列设计和酶浓度，可以灵活调整扩增效率。该策略成功地将检测信号的放大效果与发光材料的强信号输出相结合，为微量OA的准确定量提供了可靠的信号放大解决方案。

本文通过系统程序构建了一种用于检测OA的ECL生物传感器（图1）。Tb(III)-Cbatpy-MOGs复合物通过Cbatpy配体与Tb³⁺离子的配位合成，然后均匀沉积在玻璃碳电极（GCE）上。随后，DNA链S1通过Au–S键固定在Tb(Ⅲ)-Cbatpy-MOGs修饰的电极表面。值得注意的是，适配体（Apt）预先与cDNA杂交形成Apt-cDNA双链。在目标OA存在的情况下，OA特异性结合到适配体上，引起构象变化，导致Apt-cDNA双链解离并释放出自由的cDNA。释放的cDNA随后与电极表面的S1链杂交形成双链DNA结构，进而激活Exo III对双链DNA的特异性切割。Exo III识别并切割双链DNA中的cDNA链，使cDNA释放到反应系统中。释放的cDNA再次与电极表面剩余的S1链杂交，启动新一轮Exo III介导的切割，形成循环的杂交-切割-释放过程。这一过程不断循环，促进cDNA的释放和回收，同时促进Fc标记信号探针的积累，从而实现ECL信号的显著放大和选择性检测。

章节片段

实验材料和仪器

所有化学试剂均为分析级或更高纯度，所有水溶液均使用超纯水制备。4′-羧基酸-2,2':6′,2″-terpyridine（Cbatpy）购自TCI Development Co., Ltd.（日本东京）。氯化铽（TbCl₃）购自Sigma-Aldrich Co.（美国密苏里州圣路易斯）。三乙胺（TEA）和过硫酸钾（K₂S₂O₈）购自天津北辰化学试剂有限公司（中国天津）。氯金酸（HAuCl₄）也购自...

材料表征

为了全面表征Tb(Ⅲ)-Cbatpy-MOGs，采用了一系列分析技术，相应的结果展示在图1、图S1和图S2中。如图1A所示，SEM图像显示，合成的样品由形状不规则的纳米颗粒组成，尺寸分布较广，彼此紧密相连。与SEM观察结果一致，EDS元素映射清楚地证明了其均匀分布...

结论

本研究通过将新型Tb(Ⅲ)-Cbatpy-MOGs发光体与基于DNA行走器的信号放大策略相结合，开发了一种高灵敏度的ECL生物传感器。Tb(Ⅲ)-Cbatpy-MOGs在电极表面提供了稳定且强烈的ECL信号。传感机制依赖于目标触发的DNA行走器激活，该行走器沿预定义的路径自主移动，切割淬灭剂标记的链，从而显著恢复被淬灭的ECL信号。

CRediT作者贡献声明

施淑萍：数据整理、初稿撰写。张燕：实验研究、验证。杜宇：正式分析。赵传胜：实验研究。张楠：方法学设计。余臻：资金获取、撰写及审稿编辑。贾月：概念构思、监督。秦伟：项目管理、资源协调。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了山东省自然科学基金（编号：ZR2023QB115）、国家自然科学基金（编号：22405102）、山东省泰山学者青年专家专项基金（编号：tsqn202306227）以及山东省科技中小企业创新能力提升项目（编号：2025TSGCCZZB0987）的支持。