使用微量体积蛋白质微阵列对牛奶中的牛血管生成素进行定量分析

《Talanta》：Quantitative analysis of bovine angiogenin in milk using a microliter-volume protein microarray

　　

Min Kyong-Mi | Ha Sang-Oh | Yu Si-Eun | Park Hyun-Bin | Choi Jae-Won

忠北国立大学生物化学系，韩国清州，28644

摘要

牛血管生成素（bAng）是一种属于胰核糖核酸酶A超家族的14.6 kDa碱性蛋白质，在多种生理过程中发挥着重要作用，这突显了其在牛奶品质评估和保存中的重要性。质谱、电化学传感器和各种光学检测方法等定量技术可以用于监测乳制品中的bAng；然而，这些方法在实际应用中存在复杂性高、操作步骤多、成本高和通量低等瓶颈。为了解决这些问题，我们开发了一种基于荧光的高性能蛋白质微阵列，用于精确检测乳制品中的bAng。通过优化功能化玻璃载玻片上的抗体固定，该平台实现了稳定的结合亲和力（K_D = 4.809 ± 0.554 nM）和可重复的标准曲线（IC₅₀ = 24.42 ± 2.94 nM）。值得注意的是，该平台具有出色的基质耐受性，可以直接从原始牛奶样品中进行准确定量，无需任何预处理步骤，有效避免了脱脂、离心和过滤等繁琐过程。该检测方法的检测限为8.10 nM，相当于在1 μL样品体积内具有118.2 pg的质量灵敏度。使用真实牛奶样品进行的验证表明，bAng在生牛奶（3.95 μg/mL）和巴氏杀菌牛奶（3.60 μg/mL）中保持稳定，而超高温灭菌会显著降低其含量至无法检测的水平。凭借皮克级灵敏度和同时检测多个样品的能力，这种微阵列平台为乳制品质量保证和复杂生物基质中的功能性蛋白质监测提供了一种经济高效且可扩展的工具。

引言

蛋白质微阵列是一种强大的高通量筛选平台，可用于蛋白质组学研究，能够在固体表面上实现多路复用、微升级别的蛋白质丰度和生物分子相互作用分析[[1], [2], [3], [4], [5]]。这项技术有助于对大量样本进行经济有效的分析，并已在生物医学、生物制药开发和环境监测等领域得到广泛应用[[6], [7], [8], [9]]。尽管质谱仍是检测和定量目标蛋白质的参考方法，但其实际应用往往受到昂贵仪器、繁琐样品制备和高度专业化人员的需求限制[[10,11]]。相比之下，蛋白质微阵列提供了类似于酶联免疫吸附测定（ELISA）的用户友好格式，同时利用基于荧光的传感技术，在仅1 μL的样品体积下实现超高灵敏度。

牛血管生成素（bAng，也称为RNase 5）是一种属于胰核糖核酸酶A超家族的14.6 kDa碱性蛋白质[[12]]。bAng与人类血管生成素具有约65%的序列同源性[[13]]，是乳制品中的关键生物活性成分，具有多种促进健康的作用。具体而言，bAng对于诱导血管生成至关重要[[14]]，并通过调节骨吸收和形成在骨骼重塑中发挥重要作用[[15], [16], [17], [18]]。此外，bAng还表现出广谱抗菌和抗病毒活性，这些活性通常与其他牛奶蛋白质的协同作用而得到增强[[19], [20], [21]]。

鉴于其生物学重要性，bAng的浓度是评估牛奶整体质量的重要指标。然而，巴氏杀菌等工业处理过程可能会改变主要牛奶蛋白质的浓度，从而可能影响产品的营养价值和功能性[[22]]。因此，迫切需要能够监测bAng微量波动（在生牛奶中通常为3–19 μg/mL）的定量分析技术，尤其是在原始和加工乳制品中[[22]]。

传统的检测方法，包括Western blotting、ELISA、质谱和荧光偏振免疫测定（FPIA），已被用于bAng的分析，但每种方法都有各自的局限性[[12,13,19,23,24]]。例如，Western blotting、质谱和FPIA常常受到基质干扰的影响，而ELISA和FPIA则需要大量的样品和抗体[[25], [26], [27]]。特别是质谱虽然具有高特异性，但需要专门的工作流程和昂贵的基础设施[[28,29]]。此外，FPIA在牛奶分析中面临挑战，因为牛奶的高浊度和粘度会增加光散射，从而影响测量的准确性[[30], [31], [32]]。

此外，最近的分析趋势不仅限于bAng；许多研究采用了先进的平台——如电化学传感器、表面等离子体共振（SPR）和生物层干涉测量（BLI）——来检测牛奶基质中的多种蛋白质[[33], [34], [35], [36], [37]]。然而，这些方法仍然存在根本性的局限性，如操作复杂、步骤多以及依赖昂贵仪器。

为了满足快速简便的乳制品监测需求，蛋白质微阵列技术作为一种强大的替代方案应运而生，无需样品预处理即可操作。通过将抗体-抗原结合限制在微尺度表面上，该平台最大限度地减少了酪蛋白和脂肪酸等干扰成分的影响，无需进行物理分离[[38,39]]。这种直接方法简化了工作流程，具有宽动态范围和直观的数据解释[[8],[39],[40],[41]]。在这项研究中，我们旨在开发一种基于荧光免疫测定的蛋白质微阵列，用于精确定量bAng这一重要的质量指标，为乳制品研究和质量评估提供实用且高通量的工具。

章节片段

重组bAng的纯化

重组bAng的纯化方法如前所述[[42]]。简而言之，含有Bos taurus ANG的pET-28a(+)质粒被转化到E. coli Rosetta(DE3)LysS中。过表达的bAng以包涵体的形式回收，溶解在缓冲液中（6 M盐酸胍（GdnHCl）、100 mM Tris-HCl（pH 8.0）、1 mM乙二胺四乙酸（EDTA）、100 mM NaCl和10 mM二硫苏糖醇（DTT），然后在含有0.3 mM氧化谷胱甘肽（GSSG）的复性缓冲液中于4°C下复性24小时

Cy3-bAng和抗bAng抗体在蛋白质微阵列上的结合亲和力分析

用于bAng定量の荧光基蛋白质微阵列的架构如图1所示。为了确保高分析重现性和灵敏度，玻璃载玻片表面经过胺化处理并功能化为杯芳烃A。这种特殊的表面化学处理有助于抗体的一致固定和最佳取向，从而解决了传统蛋白质微阵列中常见的随机固定问题

结论

所开发的蛋白质微阵列平台通过提供快速、无需预处理的bAng定量方法，为乳制品质量控制带来了革命性的方法。我们的研究成功证明，即使存在复杂的牛奶脂质和蛋白质，经过杯芳烃A修饰的表面也能保持高特异性和灵敏度，完全消除了繁琐的纯化步骤或去除基质干扰的过程的需要。

资助

本研究得到了区域创新系统与教育（RISE）计划的支持，该计划由教育部（MOE）和韩国忠清北道共同资助（2026-RISE-11-013-01; 2026-RISE-11-013-03）。此外，还得到了韩国技术进步院（KIAT）的资助，该机构由贸易、工业和能源部（MOTIE）资助（项目编号P0017805，属于HRD工业创新计划）。

CRediT作者贡献声明

Kyong-Mi Min：概念构思、数据管理、方法学、资源准备。Sang-Oh Ha：数据管理、正式分析、方法学、软件开发、数据可视化、初稿撰写、审稿与编辑。Si-Eun Yu：方法学、软件开发、数据可视化、初稿撰写。Hyun-Bin Park：软件开发、验证、审稿与编辑。Jae-Won Choi：概念构思、资金获取、项目管理、资源协调、监督、数据可视化、初稿撰写

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

Min Kyong-Mi和Choi Jae-Won衷心感谢已故的Chang Soo-Ik教授，他的指导和支持在整个研究过程中始终是他们的动力源泉。