SEC-MALS分析多脱氧核糖核苷酸：揭示产物异质性并实现测量标准化

《Talanta》：SEC-MALS Analysis of Polydeoxyribonucleotides: Revealing Product Heterogeneity and Enabling Measurement Standardization

　　

周宝吉|冯宁|农晓倩|陈思楠|李家辉|曾兆迪|张伟平|翟晓云|李雷|米伟|胡志尚

沈阳化工大学，中国辽宁沈阳110142

摘要

复杂和高分子量的生物材料的准确分析往往很困难。聚脱氧核糖核酸（PDRN）是一种广泛用于组织修复的生物材料，其生理活性与重量平均摩尔质量（Mw）之间存在密切关联。然而，由于其复杂的 macromolecular 特性（高粘度、低溶解度和宽分子量分布），准确分析变得具有挑战性。传统的分析方法，如质谱法和凝胶电泳，在这方面存在显著局限性。尽管尺寸排阻色谱法结合多角度光散射（SEC-MALS）是主流的分析方法，但在实际应用中往往会产生不可靠且变化较大的 Mw 数据。因此，迫切需要开发一种能够提供准确和可重复结果的分析方法。在本研究中，通过系统优化多个 SEC-MALS 参数，建立了一种优化的分析方法。该方法经过严格评估，显示出可靠的准确性、重复性以及 100–8500 kDa 的宽 Mw 检测范围。随后，基于该方法，通过实验确定了适合 PDRN 的样品制备条件，确保完全溶解同时防止样品聚集。最后，将该方法应用于八个不同的 PDRN 样品，获得了稳定且一致的结果。我们的分析揭示了不同 PDRN 样品之间之前被忽视但显著的 Mw 特性差异，这些差异也体现在分散度（D）和低分子量片段的比例上。这些变化突显了质量控制和产品一致性方面的关键挑战。对实验数据的全面分析加深了我们对 PDRN 的理解。对于制造商而言，准确的 Mw 测定必须结合分散度（D）的分析，后者是样品表征的关键参数。该方法的宽分析范围确保了对其范围内样品的准确和可比分析，为实现批次间一致性提供了可靠的分析工具。

引言

聚脱氧核糖核酸（PDRN）是一种从鲑鱼生殖细胞中提取的生物材料，具有高粘度、低溶解度和宽分子量分布[1] [2]。其分子量通常在 50-1500 kDa 之间[3]。PDRN 已被证明具有多种生理活性。例如，在抗炎作用方面，它通过激活 A2A 受体和抑制 JAK/STAT 信号通路来减少炎症反应，同时延缓神经元细胞死亡[4] [5]。在组织修复方面，PDRN 通过多种机制加速伤口愈合并减少疤痕形成：刺激血管内皮生长因子的产生；通过 salvage 途径提供嘌呤和嘧啶以加速 DNA 合成；调节细胞凋亡并促进胶原蛋白合成[6] [7]。此外，PDRN 通过减少黑色素生成相关基因的表达和抑制酪氨酸酶活性来抑制黑色素生成[8] [9]。研究还表明，PDRN 在改善关节炎、筋膜炎和滑囊炎相关的临床症状方面具有良好效果[10]。

当前研究表明，PDRN 的重量平均摩尔质量（Mw）与其生理活性密切相关。Mw 是按摩尔质量加权的统计平均值。与数平均摩尔质量相比，Mw 对大分子成分更敏感，能更准确地反映高摩尔质量基质对样品整体性能的贡献[11]。低 Mw 的 PDRN 具有更好的吸收性，而高 Mw 的 PDRN 则提供结构支持和保湿作用[12] [13]。因此，Mw 成为制造商的关键质量控制参数，准确的 Mw 分析至关重要。这种复杂性，表现为高粘度、低溶解度和宽分子量分布，给准确分析带来了重大挑战[14] [15]。传统的分析方法不足以进行准确分析[16]。例如，质谱法（MS）是测量低分子量纯核酸 Mw 的先进技术，具有高灵敏度、准确性和结构信息[17] [18]。然而，较长的 DNA 链在电离过程中可能会断裂。此外，随着链长的增加，电喷雾电离（ESI）会产生越来越宽的电荷状态分布，导致质谱图中的离子信号分布在较宽的质荷比（m/z）范围内。对于像 PDRN 这样高度多分散的样品，这种电荷状态的复杂性因宽分子量分布而进一步放大，导致在任何给定的 m/z 值处信号严重稀释，使得可靠的去卷积变得不切实际。因此，传统 MS 通常无法为 PDRN 恢复有意义的分子量谱[19]。此外，凝胶电泳的灵敏度和选择性限制了其清晰区分 PDRN 条带的能力[20]。

值得注意的是，电荷检测质谱法（CDMS）是一种适用于兆道尔顿生物分子的技术。与传统 MS 不同，CDMS 可同时测量单个离子的 m/z 和电荷，从而避免了传统 MS 分析大而异质分析物时遇到的信号稀释和去卷积问题[21] [22]。随着 CDMS 技术的发展及其与其他技术的结合，预计可以使用该技术实现 PDRN 的准确分析[23]。

目前，大多数制造商使用尺寸排阻色谱法结合多角度光散射（SEC-MALS）来分析 PDRN 样品。MALS 是聚合物 Mw 特性分析的主流技术[24] [25]。当 MALS 与 SEC 柱和紫外检测器或差示折射率（dRI）检测器结合时，该技术可以提供多种分析数据，包括 Mw 和分散度（D）[25] [26] [27]。D 是样品内分散程度的度量。D 是由重量平均摩尔质量与数平均摩尔质量之比（Mw/Mn）得出的，是衡量分子量分散程度或多分散性分布函数的指标[28]。然而，这种方法在分析 PDRN 时也有其局限性。在实际应用中，实现稳定和可重复的分析具有挑战性，经常导致不可靠的 Mw 数据或显著变化[29]。这些局限性影响了 Mw 数据的可靠性，成为 PDRN 质量控制标准化的重大障碍。

在本研究中，我们通过改进系统条件和样品制备程序步骤，建立了一种优化的 SEC-MALS 方法及其相应的样品制备方案。使用多个标准样品对优化方法的性能进行了严格评估，并随后将其应用于分析八个不同 Mw 的 PDRN 样品。这使我们能够研究不同样品之间的一致性，发现不同来源样品在 Mw 特性、D 和低分子量片段比例方面存在显著且之前未报告的差异。这些差异可能归因于生产过程的差异，并可能影响生物活性，突显了建立稳健分析标准的必要性。因此，这种准确且可重复的方法不仅有助于 PDRN 质量控制的标准化，还为制造商提供了监测和优化关键生产参数的工具。这将有助于确保批次间一致性和可靠的治疗效果。

章节片段

化学品和材料

代表性的人 IgG1_k 单克隆抗体参考物质 GBW(E)091164（NIMCmAb；中国国家计量院），聚维吡咯烷酮（重量平均摩尔质量 GBW(E)130783；PVP 参考物质；中国国家计量院），四种具有不同碱基对长度的质粒 DNA 对照品（100 bp、1500 bp、5000 bp、13000 bp），叠氮化钠（Sigma-Aldrich，上海，中国），超纯水（Watsons 广州，中国），氯化钠（NaCl；北京东方

SEC-MALS 系统的优化

PDRN 的 SEC-MALS 分析中的一个主要挑战是系统不稳定，主要是由于样品引起的柱子降解。我们发现 PDRN 会显著且不可逆地损害柱子性能，导致分辨率随时间逐渐下降。因此，我们的方法优化集中在两个关键方面。首先是防止压力积累和柱子堵塞，这是之前方法的主要问题

结论

在这项研究中，为了解决复杂生物样品 PDRN 的准确和稳定 Mw 测定问题，我们建立了一种优化的 SEC-MALS 方法，同时优化了样品预处理方案和 SEC-MALS 参数。通过严格的方法验证，证明了该方法的准确性、稳定性和宽检测范围。利用这种改进的方法，我们测量了八个不同的 PDRN 样品。除了 Mw 测定外，该方法还应用于

CRediT 作者贡献声明

曾兆迪：监督。张伟平：方法学。翟晓云：资源。李雷：监督。冯宁：资源。农晓倩：撰写 – 审稿与编辑。陈思楠：方法学。李家辉：正式分析。米伟：资金获取。胡志尚：撰写 – 审稿与编辑，资金获取。周宝吉：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，方法学

注释

作者声明没有竞争利益。

资金来源

本研究由中国国家计量院的基础科学研究重点项目（AKYZD2114-1）和中国的国家重点研发计划（2021YFF0600702）资助。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。