《Talanta》：Luminescence-guided engineering of anti-idiotype nanobody-NanoLuc fusion reagents for sensitive monitoring of free therapeutic antibodies
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阿德里亚娜·卡洛马尼奥（Adriana Carlomagno）|保拉·塞戈维亚-德洛斯桑托斯（Paula Segovia-de los Santos）|马卡雷娜·皮雷斯-希尔默（Macarena Pírez-Schirmer）|阿尔瓦罗·丹扎（Alvaro Danza）|玛丽亚·
阿德里亚娜·卡洛马尼奥（Adriana Carlomagno）|保拉·塞戈维亚-德洛斯桑托斯（Paula Segovia-de los Santos）|马卡雷娜·皮雷斯-希尔默（Macarena Pírez-Schirmer）|阿尔瓦罗·丹扎（Alvaro Danza）|玛丽亚·贝伦·克拉姆佩特（María Belén Crampet）|加布里埃尔·拉萨贝（Gabriel Lassabe）|瓜尔贝托·冈萨雷斯-萨皮恩扎（Gualberto González-Sapienza）
乌德尔阿尔大学医学院（UDELAR）临床医学学术单位
摘要
治疗性抗体的监测需要能够在复杂生物基质中结合高灵敏度、特异性和稳健性的生物分析平台。在这里，我们报告了一种灵敏的生物发光桥接免疫测定方法，该方法使用抗独特型纳米体-NanoLuc融合试剂来检测游离的、可结合到抗原表位（paratope）的治疗性抗体。为了简化试剂制备过程，我们实施了一种基于发光引导的工作流程，该流程包括用治疗性单克隆抗体混合物对骆驼科动物进行免疫、通过竞争性噬菌体展示技术富集针对阿达利姆单抗（adalimumab）的结合蛋白，并在大肠杆菌中直接筛选富集后的纳米体-NanoLuc融合蛋白。这种方法能够早期识别出高活性的嵌合体，同时保持功能特异性，克服了在测定开发过程中常见的纳米体表达瓶颈。选定的结合蛋白被纳入桥接测定格式中，使用生物素化的纳米体作为捕获试剂，以及纳米体-NanoLuc嵌合体作为信号生成试剂。所得到的测定方法在0-50 ng/mL范围内表现出线性响应（R2 = 0.998），检测限为0.22 ng/mL。在临床相关的治疗范围内对添加了阿达利姆单抗的人血清进行的回收研究表明，该方法具有高准确性和精确度。将该方法应用于有限数量的临床分层患者样本后，得到的测量结果与预期的治疗反应状态一致。这些结果支持了一种用于游离治疗性抗体监测的模块化生物分析工作流程，并为免疫测定应用中选择功能性Nb-NanoLuc试剂提供了依据。
章节片段
引言
治疗性单克隆抗体（mAbs）在自身免疫、炎症和肿瘤学领域的临床应用持续扩展[1]、[2]。治疗性药物监测已成为优化剂量、解释治疗反应失败情况以及指导治疗决策的宝贵工具，最终改善了患者的治疗效果[3]、[4]、[5]、[6]。因此，可靠地量化循环中的药物水平是一个重要的分析挑战。然而，并非所有治疗性靶点都
材料
本研究使用了阿达利姆单抗（HUMIRA?，AbbVie）、托西珠单抗（ACTEMRA?，Roche）、利妥昔单抗（MABTHERA?，Roche）和奥马珠单抗（XOLAIR?，Novartis）作为参考治疗性抗体。人IgG（IgGh）来自Athens Research & Technology（美国乔治亚州雅典市）。Furimazine来自CSNpharm（美国伊利诺伊州阿灵顿高地）。白色和透明的高结合力96孔ELISA板及96深孔培养块来自Greiner Bio-One（美国北卡罗来纳州门罗市）。限制性酶和分子生物学试剂来自
阿达利姆单抗抗表位抗体的选择
生成单域抗体的常用策略是用多种抗原混合物对动物进行免疫，从而产生多特异性库，这些库可作为分离针对每个特定抗原的纳米体的共同来源，并减少动物使用量。根据跨物种抗体最具免疫原性的区域是表位这一前提
结论
我们提出了一种工作流程，用于选择和实施单域抗体作为桥接免疫测定和更广泛意义上的夹心免疫测定格式中的捕获和检测试剂。该策略整合了基于混合物的免疫、竞争性筛选以优化表位特异性，以及早期融合水平筛选以简化克隆优先级确定。正如本研究所示，使用相关治疗性抗体进行免疫虽然非常实用，但可能会促进交叉反应
CRediT作者贡献声明
阿德里亚娜·卡洛马尼奥（Adriana Carlomagno）：撰写——原始草稿、数据可视化、实验设计、数据分析。加布里埃尔·拉萨贝（Gabriel Lassabe）：撰写——审稿与编辑、监督、资金获取。玛丽亚·贝伦·克拉姆佩特（María Belén Crampet）：监督、方法学设计。瓜尔贝托·冈萨雷斯-萨皮恩扎（Gualberto González-Sapienza）：撰写——审稿与编辑、原始草稿撰写、监督、资金获取、概念构思。阿尔瓦罗·丹扎（Alvaro Danza）：撰写——审稿与编辑、概念构思。马卡雷娜·皮雷斯-希尔默（Macarena Pírez-Schirmer）：验证、数据分析。保拉·塞戈维亚-德洛斯桑托斯（Paula Segovia-de los Santos）：
在准备本工作时，作者使用了ChatGPT（OpenAI）进行语言编辑和文本优化。使用该工具后，作者根据需要对内容进行了审查和修改，并对出版物的内容负全责。
? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
致谢
CSIC的资助（项目编号：2309-347-2022）。AC和PS-S获得了乌德尔阿尔大学研究生学术委员会的奖学金。作者感谢患者和未接受治疗的捐赠者提供用于本研究的血清样本。
