一种基于可压缩壳聚糖冷冻凝胶的动态核酸提取平台，用于检测食源性病原体

《Talanta》：A dynamic nucleic acid extraction platform based on compressible chitosan cryogel for foodborne pathogen detection

　　

李伟轩|曹丽敏|隋建新|林红|王凯青|王秀丹

中国海洋大学食品科学与工程学院海洋食品加工与安全控制国家重点实验室，山东省青岛市266404

摘要

核酸的提取和纯化对于检测食源性病原体至关重要，但传统方法往往受到操作复杂性和对专用仪器依赖的限制，这限制了它们在资源匮乏环境中的使用。本文报道了一种基于壳聚糖衍生的海绵状冷冻凝胶（CSC）的简单高效核酸提取平台，该平台能够在温和条件下实现动态吸附-洗脱分离。CSC具有较高的核酸结合能力（每10毫克材料可结合88微克DNA和305微克RNA），并且吸附动力学符合伪二级模型。等温分析表明，RNA和DNA的结合分别遵循朗缪尔（Langmuir）和弗伦德利希（Freundlich）模型，这表明其结合机制包括静电相互作用和物理缠结。值得注意的是，CSC的可压缩性和形状可恢复性使其通过简单的抽吸-压缩操作即可实现动态提取，无需外部设备。在实际应用中，我们将CSC集成到巴斯德吸管中，构建了一种便携式提取装置。该系统能够快速从细菌培养物和牛奶样本中提取副溶血性弧菌和沙门氏菌的核酸，并可直接用于聚合酶链反应（qPCR）和重组酶聚合酶扩增（RPA）-规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/Cas12a检测。该方法检测灵敏度可达10³ CFU·mL^-1，优于商业试剂盒。重要的是，整个提取过程避免了使用变性盐、有机溶剂和复杂仪器，提供了一种简化且环保的替代方案。这项工作为核酸纯化提供了一种实用且可扩展的策略，具有在食品安全现场检测中的潜在应用价值。

引言

基于核酸的分子诊断技术在食品安全中发挥着关键作用，因为它们具有高灵敏度、特异性和可重复性[1]、[2]。核酸提取是聚合酶链反应（PCR）、环介导等温扩增（LAMP）和重组酶聚合酶扩增（RPA）等分子检测技术的前提步骤[3]、[4]。传统的核酸纯化方法主要依赖于使用苯酚和氯仿等有机溶剂的液-液提取[5]、[6]，这一过程相对复杂、耗时且对环境有害。相比之下，固相提取（SPE）通过将核酸吸附到硅胶膜[7]、[8]和磁珠[9]、[10]等固体载体上，提供了一种更简单、更高效的方法。尽管这些方法可以获得较高的回收效率，但通常需要高浓度的变性盐以及多次洗涤和离心步骤，这限制了它们在资源匮乏环境中的应用。

在过去五年中，开发了多种核酸提取平台，主要侧重于材料简化和设备微型化。基于纸基和薄膜材料的提取方法已成为简化核酸捕获和纯化的代表性方法。例如，纤维素滤纸和玻璃纤维基质已被广泛用于构建快速且用户友好的提取平台[11]、[12]。然而，这些系统通常需要高浓度的变性盐和/或额外的表面功能化处理以引入有效的核酸结合位点。此外，非特异性吸附和选择性有限仍然是纸基材料的主要挑战[13]。基于聚合物离子交换吸附剂的薄膜微提取平台也被开发出来作为另一种策略[14]、[15]。虽然这些系统可以实现核酸的静电吸附，但其结合能力受到表面积有限和扩散控制的质量传递的限制。此外，最近的研究还探索了用于现场检测的便携式和集成核酸提取系统。例如，基于磁珠的提取技术已被整合到微流控或芯片设备中，通过顺序操作磁珠来实现裂解、结合、洗涤和洗脱[16]、[17]。同样，基于硅胶的吸管尖端柱也能实现快速提取[18]，但仍依赖于变性盐来实现有效的核酸结合。尽管有效，但这些系统仍涉及多个操作步骤，包括重复混合、磁珠固定和腔室切换，增加了操作复杂性。

当前核酸提取策略的一个关键限制在于它们依赖于静态吸附过程，其中质量传递主要受扩散控制。这导致提取效率降低和处理时间延长，特别是在简化或微型化系统中。需要开发能够增强质量传递同时简化操作流程的替代提取平台，以便在温和和资源有限的条件下实现高效的核酸纯化。壳聚糖是一种天然多糖，由于其内在的生物相容性和丰富的氨基基团[19]、[20]，成为核酸提取的理想材料。壳聚糖在大约5.0的弱酸性pH值下可以质子化，从而获得正电荷，与带负电的核酸产生强烈的静电相互作用。相比之下，它与其他生物分子（如蛋白质）的相互作用相对较弱[21]、[22]。研究人员已经用壳聚糖对多种基底进行了功能化处理，包括滤纸、尼龙膜、硅胶膜、金纳米颗粒和聚二甲基硅氧烷（PDMS）表面，以增强核酸结合[20]、[22]、[23]、[24]、[25]。研究表明，用壳聚糖修饰多孔材料可以促进PCR、LAMP、RPA或链交换扩增（SEA）的原位扩增[19]、[20]、[22]、[24]、[25]。这些方法主要利用壳聚糖作为功能化各种基质的物质，而忽略了其通过交联形成三维多孔结构的内在能力[26]。壳聚糖可以被工程化为具有高孔隙率和互连通道的海绵状三维结构[27]，从而促进快速的质量传递并为核酸提供丰富的结合位点。这种结构有望将传统的静态SPE策略转变为动态微提取系统，从而解决现有核酸提取平台的关键限制，包括对变性试剂的依赖、结合能力有限和操作复杂性。

基于这一概念，开发了一种基于壳聚糖的海绵状冷冻凝胶（CSC）作为动态核酸提取平台。与传统SPE策略不同，CSC具有可压缩性和高度多孔的三维网络，能够实现动态吸附-洗脱过程。CSC通过冷冻与环氧氯丙烷（ECH）共价交联制备而成，无需额外修饰[28]。所得材料在酸性环境中具有丰富的氨基基团用于核酸结合，并具有高度多孔和弹性的结构。通过将CSC集成到巴斯德吸管中，构建了一种简单的类微流控提取装置，通过手动操作即可实现核酸提取。该装置通过简单的吸吮和挤压即可完成核酸提取，无需使用任何有机溶剂和变性盐。此外，这种基于巴斯德吸管的CSC装置提供了一种快速、用户友好且便携的核酸提取解决方案，在资源匮乏环境中具有巨大的现场检测食源性病原体的潜力。

章节摘录

材料和试剂

壳聚糖（CS，粘度：200–600 mPa·s；脱乙酰化程度：80.8%；平均分子量：2 MDa）购自东京化学工业（上海，中国）。环氧氯丙烷（ECH）、氢氧化钠（NaOH）、乙醇和异丙醇购自新华制药试剂（上海，中国）。氯仿和盐酸（HCl）购自昆山金城试剂（江苏，中国）。RNAiso Plus和TB Green? Premix Ex Taq? II购自Takara Biomedical Technology（北京，中国）。Lba Cas12a

CSC的制备和应用

在保持壳聚糖氨基功能的同时构建高度可压缩的三维结构是开发基于壳聚糖的核酸捕获材料的关键挑战。在此，我们采用了一系列制备策略来制备具有保留氨基功能的海绵状壳聚糖冷冻凝胶（图1A）。简而言之，首先将壳聚糖溶解在HCl溶液中，将其分解成单个链，以便后续进行共价

CRediT作者贡献声明

李伟轩：撰写——原始草稿、可视化、方法学、研究、数据分析、数据整理。曹丽敏：撰写——审稿与编辑、监督、研究、概念化。隋建新：撰写——审稿与编辑、监督、方法学、概念化。林红：撰写——审稿与编辑、监督、概念化。王凯青：撰写——审稿与编辑、监督、方法学、概念化。王秀丹：撰写——审稿与编辑、撰写——

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

利益冲突声明

? 作者声明没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了中华人民共和国科学技术部的国家重点研发计划（编号：2023YFD2403000的支持。