结构表征辅助聚乙二醇二缩水甘油醚（PEGDE）取代透明质酸的理性设计

《Synthetic and Systems Biotechnology》：Structure characterization assists rational design of polyethyleneglycol diglycidyl ether (PEGDE) substituted hyaluronic acid

　　

聚乙二醇二缩水甘油醚（PEGDE）是一种新一代交联剂，具有低毒性和改善弹性的优点。PEGDE-透明质酸（HA）的理化性质与其修饰度（MoD）、有效交联剂比例（CrR）以及修饰类型/位置密切相关。在本研究中，研究人员开发了一种结构分析方法，用于全面表征PEGDE交联的HA。结合高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）分析，准确测量MoD和CrR参数，并明确地定位修饰位点/残基。利用已建立的方法，研究人员首次鉴定了水凝胶中链内交联结构的存在，并揭示了不同条件下合成的水凝胶在结构和流变性能上的差异。从该分析方法中获得的见解可用于指导制造过程，以生成具有“定制”结构以适应不同应用场景的HA水凝胶。

透明质酸（HA）是一种线性高分子多糖，广泛分布于结缔组织和体液中，但其体内半衰期短，易被内源性透明质酸酶降解。为延长其半衰期，需通过交联技术增强稳定性。物理交联依靠非共价相互作用，而化学交联则利用多官能团交联剂形成共价键网络，其中1,4-丁二醇二缩水甘油醚（BDDE）是常用交联剂。聚乙二醇二缩水甘油醚（PEGDE）作为新一代交联剂，具有低毒性和改善弹性的优势，但其分子量较高且含可变重复单元（(CH₂–CH₂–O)_n，M_n=500），使水凝胶结构更复杂。传统方法（如基于核磁共振的分析）无法区分连接模式或定位修饰位点，且缺乏对链内交联结构的认知。因此，研究人员迫切需要一种能够全面表征PEGDE-HA水凝胶的修饰度（MoD）、有效交联剂比例（CrR）、连接模式和修饰位点的分析方法。本研究旨在开发一种结合高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）和酶解的技术，以实现对PEGDE-HA水凝胶分子结构的精确解析，并揭示合成条件与结构及流变性能的关系。该论文发表在《Synthetic and Systems Biotechnology》。

研究人员开展了以下研究：首先利用梯度酶解（使用透明质酸酶B）将PEGDE-HA水凝胶降解为寡糖，并通过超高效尺寸排阻色谱-高分辨质谱（UPSEC-HRMS）测定MoD和CrR；随后对酶解产物进行硼氢化钠还原，以消除端基异构现象，再利用多孔石墨碳色谱-质谱（PGC-MS）分析修饰位点和连接模式；最后通过在线LC-MS/MS及MS³实验鉴别单连接、链间交联和链内交联寡糖的结构。通过对比不同合成条件（原料比例、温度、时间）下水凝胶的MoD、CrR、修饰位点分布和流变参数（储能模量G′和损耗模量G″），探讨了结构-性能相关性。

**3.1 通过UPSEC-HRMS测定MoD和CrR**
通过梯度酶解（HAase-B用量10~80 kU）实现水凝胶的彻底降解，发现80 kU时寡糖分布趋于稳定（2-P结构占比达82%）。高分辨质谱检测到n值（PEGDE重复单元数）为1~25的寡糖，其中n=8最为丰富，但较小n值的PEGDE反应活性更高（尤其n=3倾向形成链内2-P结构）。基于各寡糖提取离子色谱峰面积计算MoD和CrR，结果表明线性关系良好（R²>0.99），验证了定量方法的可靠性。

**3.2 水凝胶中交联网络的评估**
硼氢化钠还原后，PGC色谱分离使异构体清晰分峰。相同寡糖（如2-P）的不同n值产物保留时间偏移但峰形一致，说明n值不影响连接模式。因此选取信号最强的n=8进行后续结构解析。

**3.2.1 单连接寡糖的结构鉴定**
对2-P寡糖的5个峰进行CID碎裂分析：峰1–3中Y1离子（722.38）指示修饰发生在N-乙酰-d-葡萄糖胺（GlcNAc）残基，其中峰3的Y1/Z1比值较高表明为-OH⁶取代；峰4–5的^0,2A1离子（115.00）表明d-葡萄糖醛酸（GlcA）残基在-OH²修饰。对4-P寡糖的4个峰，结合MS³实验确定峰1–2修饰于还原端GlcNAc的-OH⁴，峰3–4修饰于中间GlcA的-OH³。

**3.2.2 源自交联或链内连接区域寡糖的结构鉴定**
链间交联生成的2-P-2寡糖（m/z 1243.5202，n=8，z=1）经CID碎裂后，通过Y1/Y3（927.47）、Y3（1085.49）和B3（1020.41）等诊断离子区分了GlcNAc-P-GlcNAc、GlcNAc-P-GlcA和GlcA-P-GlcA三种连接模式。同时检测到m/z 1241.5041的2-P-2寡糖，根据其对过量酶解的敏感性差异，区分了-OH¹修饰（源自多糖还原端）和链内4-P结构（源自链内交联）。此外，链内2-P寡糖的CID分析发现了GlcNAc-P-GlcA、GlcNAc-P-GlcNAc和GlcA-P-GlcA等多种连接模式。这是首次在PEGDE-HA水凝胶中确认链内交联结构的存在。

**3.3 HA水凝胶的比较分析**

**3.3.1 合成条件与水凝胶结构的关联**
比较三组条件（不同HA/PEGDE比例和温度）下九个样品，发现MoD和CrR随反应时间延长而升高；温度影响两者，而PEGDE/HA比例显著影响MoD但几乎不影响CrR。修饰位点分布（以-OH⁴为主）基本不受合成条件影响，表明HA链的构象可能主导了交联位点选择。

**3.3.2 水凝胶的流变特性**
所有样品的G′均大于G″，表现出弹性行为。高交联样品（CrR>20%）的G″随频率升高而降低，低交联样品（CrR<20%）的G″则轻微上升。G′与MoD和CrR呈正相关（除条件1前两个时间点外），说明条件1可能引起HA链轻度裂解而降低弹性。

**总结讨论与结论**
通过对酶解产物的梯度分析和质谱鉴定，研究人员首次同时识别了链间和链内交联结构，突破了以往仅关注MoD和CrR的认知局限。该分析方法可全面表征PEGDE-HA水凝胶的结构参数（MoD、CrR、修饰位点和连接模式），并揭示合成条件对结构与流变性能的影响。研究结论指出：本研究建立了一种强大且高灵敏的分析方法，能够描绘PEGDE-HA水凝胶的基本结构参数。通过梯度酶解实验，首次发现并确认了链内和链间结构的共存。基于此方法，研究了不同合成条件与产物分子结构和流变参数的相关性。这些发现可指导设计具有目标MoD、CrR和机械性能的水凝胶，推进特定应用场景下的水凝胶定制化，同时为交联HA水凝胶的质量控制提供了方法学工具。