综述：合成生物学视角下的工程菌在疾病诊断与治疗中的应用

《Synthetic and Systems Biotechnology》：Engineered bacteria in disease diagnosis and therapy: A synthetic biology perspective

　　

合成生物学是一门融合现代生物学等多学科知识与技术的交叉领域，旨在通过设计构建新型生物系统或对现有生命形式进行改造。其核心关键技术涵盖成簇规律间隔短回文重复序列/相关蛋白9（CRISPR/Cas9）等基因编辑技术、DNA组装技术、体内定向进化技术，以及与人工智能的深度融合。这些技术的发展极大推动了合成生物学在医学领域的应用。在疾病诊断方向，工程菌已展现出可观的应用前景：通过设计使其感知疾病特异性信号并产生可检测的报告输出，为早期诊断和实时病情监测建立了全新范式，例如经合成生物学改造的工程菌已被开发为“活体传感器”，用于检测疾病生物标志物。在治疗应用层面，合成生物学为微生物治疗疾病提供了全新思路：研究人员可设计并构建具备定制化功能的微生物，用于靶向药物递送、免疫治疗及微生物组调控。这些应用不仅提升了治疗的精准度与有效性，更为克服传统治疗手段的局限性提供了创新解决方案。尽管潜力显著，工程菌的临床转化仍面临诸多挑战，包括确保体内稳定定植、控制免疫原性、规范规模化生产，以及建立健全的监管与伦理框架。本综述系统总结了旨在提升细菌疗法安全性与有效性的工程策略，以期优化细菌功能，拓展其在诊断学与精准医疗领域的应用潜力。

本文主体围绕合成生物学改造工程菌用于疾病诊疗的研究进展与挑战展开，各章节内容如下：

1. 1.
   引言
   合成生物学作为一门融合分子生物学、系统生物学、工程学、计算机科学与材料科学的新兴交叉学科，遵循工程学原理设计构建新型生物系统或重构现有系统，继DNA双螺旋结构发现与人类基因组计划完成后，被视为第三次生物技术革命。该术语最早由Barbara Hobom于20世纪80年代提出，用于描述经重组DNA技术改造的基因工程菌。1978年Genentech公司宣布利用大肠杆菌成功生产重组人胰岛素，并于4年后获美国食品药品监督管理局（FDA）批准上市，成为工程微生物治疗潜力的标志性案例。早期研究受限于基因编辑工具不足，应用存在局限；近年来CRISPR-Cas9等精准基因编辑工具的出现，推动了人工基因回路设计与复杂代谢通路重构的快速发展，使合成生物学在医学领域取得突破性进展。经合成生物学改造的微生物凭借可编程性优势，通过精准重写基因组可定向调控细胞按需产生治疗分子或执行完整代谢通路，例如研究者开发的合成益生菌可通过产生乳酸激活树突状细胞中缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）-NDUFA4L2信号通路，抑制中枢神经系统自身免疫反应；另有研究将磁性纳米材料与工程菌结合，实现磁场调控的时空特异性细菌裂解与药物释放，激活抗肿瘤免疫反应，协同治疗结直肠癌原发灶与远端转移灶。工程菌同时兼具诊断功能，如集成荧光报告、碱基编辑与药物分泌三模块的“智能”全细胞工程菌i-ROBOT，可在体内同步实现炎症性肠病（IBD）的诊断、信息记录与病情改善。尽管应用潜力巨大，工程菌临床转化仍面临体内稳定定植、免疫原性控制、规模化生产标准化等挑战，亟需同步完善监管政策与伦理审查体系，平衡创新与安全。
2. 2.
   合成生物学核心技术
   合成生物学整合生物学、工程学、计算机科学与化学等多学科知识，核心目标为设计构建具备特定功能的新型生物系统，其核心技术包括：
   2.1 基因编辑技术
   CRISPR-Cas9凭借操作简便、效率高、脱靶率低等优势，成为构建稳定治疗菌株的首选工具。研究人员利用该技术对多种益生菌底盘进行基因敲除或整合，例如通过CRISPR技术精简肺炎支原体基因组，删除毒力因子基因并工程化改造使其分泌抗菌肽与分散素B，有效清除体内金黄色葡萄球菌生物膜；将靶向多重抗生素耐药基因I型CRISPR-Cas系统整合至大肠杆菌Nissle 1917（EcN）染色体，阻断耐药基因水平转移效率达99%以上；近期开发的噬菌体辅助平台可实现长达100 kb DNA的无痕整合，将红霉素生物合成通路与多输入基因回路导入大肠杆菌，突破了传统质粒系统的不稳定性限制，拓展了工程菌生产复杂天然产物与执行多阶段治疗的能力。
   2.2 DNA组装技术
   Gibson组装、Golden Gate克隆等技术实现了多基因组成的复杂代谢通路与合成基因回路的高效构建。例如研究者利用此类技术将3-羟基丁酸合成通路精准整合至EcN基因组，获得的工程菌株可在肠道持续产生3-羟基丁酸，改善肠道微环境并缓解小鼠结肠炎症状，解决了质粒系统在体内易丢失不稳定的问题。
   2.3 体内定向进化技术
   该技术通过实验室模拟自然选择加速筛选获得目标表型突变体，相较于传统依赖多轮诱变的定向进化，新兴的体内连续进化技术大幅提升了效率。代表性技术包括：哈佛大学David R. Liu团队开发的噬菌体辅助连续进化（PACE）技术，将蛋白质实验室进化与噬菌体生命周期耦合，通过迭代噬菌体复制实现快速连续进化，速度较传统方法提升约100倍且无需人工干预；加州大学欧文分校Chang Liu实验室开发的正交复制系统（OrthoRep），利用正交DNA聚合酶-复制子对实现用户定义基因的体内连续突变，不改变全局突变率；英国医学研究委员会分子生物学实验室Jason Chin团队建立的基于噬菌体PRD1衍生复制子的正交复制系统，利用不复制宿主基因组的OrthoDNA聚合酶（O-DNAP）在大肠杆菌中实现≥16.5 kb cargo的大规模加速连续进化；此外还有结合CRISPR碱基编辑器与平板筛选的CRISPR引导定向进化技术，兼顾操作便捷性与工程改造能力。这些技术可用于进化细菌传感器激酶，使其能够响应此前无法识别的非天然小分子信号，为构建实时检测肠道代谢物的体内诊断传感器奠定基础。
   2.4 与人工智能的融合
   人工智能正深刻重塑合成生物学研究范式，在元件工程、基因回路设计与代谢工程中显著提升研发效率。元件工程领域，生成对抗网络等深度学习模型可用于功能性蛋白序列与启动子的从头设计，加速天然元件优化；基因回路设计中，计算机模拟可在实验前预测回路动态行为，例如研究人员利用人工神经网络重构细菌间通讯逻辑，创建可识别分类化学信号模式的“感知机”；代谢工程领域，AI驱动的代谢模型可从海量数据中快速识别最优干预靶点，如BioAutomata机器人平台结合AI引导的设计-构建-测试-学习循环，在无人工干预下成功优化番茄红素生物合成通路，展现了AI在自动化菌株构建中的巨大潜力。
3. 3.
   在疾病诊断中的应用
   工程菌已成为极具潜力的新型诊断平台，通过合成生物学改造为“活体传感器”，可检测疾病生物标志物并产生相应信号，用于早期筛查、病情进展监测与治疗反应追踪，提供无创、实时的监测工具。这类系统整合RNA立足开关传感器与冻干细胞游离转录翻译系统，结合核酸序列依赖性扩增（NASBA）技术可将检测灵敏度提升至飞摩尔级别，能够区分艰难梭菌活动性感染与无症状携带状态，为微生物组分析提供了简便的替代方案。麻省理工学院团队设计的工程菌可在感知硫代硫酸盐等特定肠道代谢物或炎症因子时激活荧光报告基因，通过分析粪便样本实现克罗恩病或溃疡性结肠炎的早期诊断。另一研究对乙酸钙不动杆菌进行工程化改造，使其特异性识别结直肠癌（CRC）相关突变基因（如KRAS^G12D），利用天然水平基因转移（HGT）能力与CRISPR-Cas系统区分肿瘤DNA单碱基突变，在小鼠模型中成功整合肿瘤释放的DNA并通过抗生素耐药基因报告事件，无需样本纯化即可高灵敏度检测肠道游离DNA，为CRC早期筛查提供非侵入性方案。这些案例体现了工程菌在疾病诊断中的多样性，从肿瘤DNA检测到炎症标志物感知，通过基因回路设计或表面工程赋予细菌“智能感知”能力，具备无创、高灵敏、原位实时监测的优势，未来有望与微流控或可穿戴设备整合，推动个性化医疗发展。
4. 4.
   在治疗中的应用
   合成生物学为微生物治疗疾病提供了新视角，通过基因工程构建具备定制化功能的微生物，用于靶向药物递送、免疫治疗、微生物组调控，提升治疗精准度并克服传统疗法局限：
   4.1 药物递送
   利用基因工程使微生物在特定生理条件下（尤其是肿瘤微环境）释放药物。例如工程化EcN表达由基质金属蛋白酶（MMP）切割位点连接的Tum-5与p53融合蛋白，实现抗癌基因靶向递送至肿瘤缺氧区域；开发的双细菌双药物表达系统可中和促炎因子并增强抗炎通路，口服给药减少结肠炎性细胞浸润与促炎细胞因子水平，调节肠道菌群且不加重肠道纤维化；通过定向进化与合成基因回路改造酿酒酵母，可响应特定生理信号减轻肠道炎症与纤维化；利用EcN与脂质体自组装增强抗炎能力，调节肠道上皮屏障稳态缓解溃疡性结肠炎；还可整合复杂基因回路实现药物释放动态控制，如设计感知肿瘤微环境内部信号的细菌仅在检测到肿瘤相关信号后释放抗肿瘤药物，或通过外部刺激调控，如搭载蓝光响应模块与上转换纳米粒子的EcN在近红外光照射下实现抗肿瘤因子的靶向持续释放，提升药物靶向性并减少对健康组织的损伤。
   4.2 免疫治疗与微生物群的协同作用
   免疫治疗通过激活患者自身免疫系统攻击癌细胞，合成生物学在该领域的应用备受关注。工程微生物可通过调节宿主免疫反应增强免疫疗效，例如基因工程改造粪肠球菌，通过修饰细胞壁肽聚糖结构调节免疫细胞活性；肠道微生物群组成影响免疫检查点抑制剂（ICIs）对PD-1、CTLA-4等抑制性受体的阻断疗效，特定微生物可通过调节免疫细胞代谢与功能提升免疫治疗应答率，如工程化EcN可与PD-L1阻断抗体协同清除肿瘤；利用工程益生菌搭载优化的裂解回路局部递送检查点阻断纳米抗体，或采用溶瘤矿化细菌作为局部给药的强效安全抗肿瘤免疫制剂；热敏工程菌可在30分钟内响应热刺激，在小鼠肿瘤微环境中定植后，经三轮热诱导表达治疗蛋白肿瘤坏死因子-α（TNF-α）显著抑制肿瘤生长，建立了“温控”精准操控体内工程菌的新型策略；此外工程化EcN还可作为流感疫苗，诱导小鼠呼吸道持久体液与黏膜免疫反应。
   4.3 代谢工程与微生物组修复
   工程菌在代谢工程与微生物组调控中潜力显著，可通过调节宿主代谢治疗疾病。例如将苯丙氨酸解氨酶与L-氨基酸脱氨酶基因插入EcN基因组，使其消耗胃肠道内苯丙氨酸治疗苯丙酮尿症（PKU）；开发SYNB8802工程菌有效代谢胃肠道草酸盐，数学建模预测其疗效；工程化EcN表达胰高血糖素样肽-1（GLP-1）类似物，在肥胖小鼠模型中改善肥胖、血糖与肝脂肪变性；将3-羟基丁酸（3HB）合成通路整合至EcN基因组，使工程益生菌在肠道持续产生3HB，改善肠道微环境并缓解结肠炎症状；工程化乳酸乳球菌在肠道分泌白细胞介素-10（IL-10），促进调节性T细胞分化并抑制炎症，口服给药降低结肠炎小鼠炎症评分并恢复健康微生物群落结构。更具突破性的原位微生物组编辑策略利用噬菌体递送CRISPR转座酶系统，将苯丙氨酸解氨酶基因整合至小鼠肠道原生大肠杆菌，单次治疗后实现超过6个月的持续治疗效果，规避了外源益生菌的定植挑战。
   4.4 抗感染治疗应用
   针对抗生素耐药菌这一全球公共卫生挑战，工程菌提供了创新解决方案。例如构建工程噬菌体缓解抗菌药物耐药性发展，通过定点突变T3噬菌体尾丝蛋白的宿主范围决定区（HRDRs）生成合成“噬菌体体”，改变噬菌体宿主范围并实现长期抑制细菌生长，防止耐药性产生；开发基于益生菌酵母的免疫疗法，基因工程改造布拉氏酵母菌产生四特异性抗体（ABAB）中和艰难梭菌主要毒素TcdA与TcdB，在小鼠模型中展现预防与治疗原发及复发性艰难梭菌感染的潜力，可与抗生素联用；生物工程乳酸杆菌益生菌（BLP）表达单核细胞增生李斯特菌黏附蛋白（LAP）基因，可竞争性排斥单核细胞增生李斯特菌，改善肠道屏障功能障碍并预防孕期胎儿胎盘传播；工程化肺炎支原体分泌抗菌肽与杀菌酶，有效清除体内金黄色葡萄球菌生物膜；将I型CRISPR-Cas系统整合至EcN，阻断多重抗生素耐药基因（ARGs）的转移。
   4.5 工程菌与再生医学
   微生物在再生医学中应用前景广阔，合成生物学可设计治疗性微生物利用其特性促进组织修复再生。例如构建靶向骨组织并释放骨生长因子的工程菌，促进成骨细胞增殖分化，提升骨再生效率并减少传统方法并发症。
   4.6 挑战与局限
   尽管潜力巨大，合成生物学在微生物诊疗应用中仍面临多方面挑战，主要涉及安全性与伦理、微生物稳定性与有效性、监管与市场准入障碍。
   4.7 安全性与伦理问题
   微生物基因组基因修饰引发重要安全伦理关切。首先，改造微生物可能对人体健康与环境产生不可预测影响，其在宿主体内的存活增殖可能导致本土微生物群破坏或新型病原体出现；部分应用存在生物安保风险，基因编辑技术滥用可能产生生物威胁。其次，公众对基因修饰接受度差异显著，担忧工程微生物安全性与有效性及潜在误用，伦理议题还涉及对人类尊严、公平性的尊重及应用固有不确定性，需建立完善的伦理框架，在研究设计阶段开展伦理审查，确保透明可追溯，保障可持续负责任地应用合成生物学。
   4.8 微生物有效性与稳定性
   工程微生物在复杂体内环境中的生存与功能易受温度、pH、营养可用性等因素影响，与本土微生物群的相互作用也可能削弱治疗效果。需开发更稳定的微生物载体并优化体内生存条件，例如利用合成生物学构建更复杂的基因调控网络，使工程微生物在不同条件下自我调节生理功能，提升临床稳定性与有效性，同时需针对不同疾病类型制定个性化微生物治疗策略。
   4.9 监管与市场准入困难
   合成生物学快速发展带来监管与市场准入挑战，多数地区相关微生物基因修饰法律法规尚不完善，导致监管模糊；许多国家缺乏工程微生物临床应用统一标准，为企业临床试验审批与市场准入制造障碍。市场准入还面临经济挑战，合成生物学研发通常需要大量资金投入，当前医疗市场对新兴技术投资风险厌恶，导致有前景的项目难以获得充足资金，需建立合理的市场准入机制与激励政策。
5. 5.
   局限性与展望
   工程菌疾病诊疗领域已取得显著进展，但仍面临多重技术瓶颈与转化障碍，需在未来研究中系统解决。
   5.1 技术挑战
   首先，底盘微生物遗传稳定性仍是未解决的核心问题。异源基因构建的表达会给宿主菌带来代谢负担，降低相对适合度，导致传代过程中外源构建功能逐渐丢失或衰减，即使采用染色体整合等稳定策略，长期培养中仍可能发生突变漂移或回路功能衰退。以“自杀开关”为例，其施加的选择压力易导致逃逸突变体产生，是稳定性最难维持的回路之一，研究发现细胞杀伤效力与进化稳定性呈负相关，遗传逃逸模式受回路复杂度、毒素活性、抗失活保护能力及回路内突变倾向序列驱动。其次，基因编辑工具在非模式菌株中的应用受限，目前研究多集中于EcN等少数模式菌株，针对拟杆菌属等具有独特生态位功能的共生菌，仍缺乏高效特异的基因操作工具，肠道微生物组的复杂多样性为开发人类肠道微生物基因组工程工具带来重大挑战，开发适用于多样共生菌的基因编辑系统是拓展工程菌应用范围的关键。此外，尽管生物防护策略（如自杀开关、营养缺陷型设计）已取得进展，但其在复杂体内环境中的长期可靠性仍需充分验证，未来需开发多层正交生物防护系统，最小化环境逃逸风险。
   5.2 模型与临床转化的差距
   当前工程菌研究高度依赖小鼠模型，但啮齿类与人类在肠道生理、免疫系统及微生物群落组成上存在显著差异，可能影响工程菌的定植效率与药物释放动力学。工程菌为基础的癌症治疗面临脱靶毒性、深部肿瘤组织穿透性差、耐药性出现等挑战；实体瘤内肿瘤内异质性也是难题，肿瘤内缺氧与坏死区域分布不均，可能限制工程菌靶向定植仅覆盖特定区域而非整个肿瘤。此外，患者本土肠道菌群组成个体差异显著，同一工程菌株的定植能力与治疗效果在不同个体间可能存在巨大差异，为个性化治疗策略的开发提出新问题。工程微生物系统与嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法的整合也面临生物防护、肿瘤归巢特异性机制理解不完整、严格安全性验证要求等挑战。
   5.3 标准化与监管需求
   工程菌疗法要实现临床广泛应用，相关试剂与方案需改进与标准化。目前工程菌构建与检测多为手工操作，各实验室采用自行改良的方案，缺乏标准化的效力测定方法：应以菌落形成单位、回路功能活性还是两者同时测定？大规模发酵过程中如何维持质粒稳定性与基因回路完整性？冻干制剂如何确保细菌通过胃部时的存活率？这些问题均需系统研究。关键的是，监管框架仍在演进中，活体生物治疗药物（LBPs）根据预期用途可能被归类为食品或药品，具有治疗声称的产品被定义为含有用于疾病预防或治疗的活细菌或酵母的药物产品。全球市场在立法、允许声称、市场价值与质量要求上存在显著差异，不同益生菌产品在开发不同阶段成本各异，FDA与欧洲药品管理局针对基因修饰LBPs的指南仍需进一步完善。平衡传统安全药理学研究与活体药物的独特属性（包括体内进化潜力），对监管机构而言是新挑战。最终，工程菌的衍生与构建方案必须标准化与自动化，以提升可重复性与可扩展性，为这些创新疗法从实验室研究走向常规临床应用铺平道路。