果糖-6-磷酸醛缩酶的工程化用于在设计的生物转化系统中将一碳转化为甘露醇

《Synthetic and Systems Biotechnology》：Engineering of fructose-6-phosphate aldolase for one-carbon conversion to mannitol in a designed biotransformation system

　　

开发用于将一碳化合物转化为高附加值化学品的人工合成途径代表了碳中和方法制造的一种有前景的策略。酶促C–C键形成在碳链延伸和结构多样化中起核心作用。果糖-6-磷酸醛缩酶（FSA）已被应用于体外多酶系统中从甲醇生产淀粉和糖。然而，其原子催化机制仍然不清楚，限制了理性的酶工程。在本研究中，研究人员使用量子力学/分子力学（QM/MM）计算阐明了FSA催化的二羟基丙酮（DHA）和3-磷酸甘油醛（GALP）之间的醛醇反应机制，确定了希夫碱/亚胺离子形成步骤为醛醇缩合反应的限速步骤。基于这一机制，研究人员工程化了FSA变体，与野生型相比催化效率提高了34倍。研究人员进一步将工程化的FSA整合到一个设计的体外级联反应中，将甲醇转化为甘露醇，实现了88%的高产率。总之，这些机制见解和改进的生物催化剂扩展了绿色酶促C–C键形成和一碳利用的工具箱。

**研究背景与意义**

一碳资源（如CO₂、甲醇、甲醛）的生物转化是实现碳中和方法制造的有效策略。然而，天然碳固定途径涉及复杂的反应步骤、高ATP消耗或低转化率。因此，研究人员通过代谢途径设计和酶工程构建了许多合成途径。酶促碳–碳（C–C）键形成反应能够模块化组装功能化碳骨架，为多样化长链产物提供可编程途径。果糖-6-磷酸醛缩酶（FSA）催化二羟基丙酮（DHA）与3-磷酸甘油醛（GALP）缩合生成果糖-6-磷酸（F6P），相比传统果糖-1,6-二磷酸醛缩酶途径具有更短路线和更低ATP消耗的优势。然而，FSA的完整原子催化机制尚不清楚，限制了理性工程以提高活性与底物特异性。本研究旨在通过量子力学/分子力学（QM/MM）计算揭示催化循环，并基于机制进行酶工程改造，最终将工程化FSA整合到体外级联系统中从甲醇生产甘露醇。该研究发表在《Synthetic and Systems Biotechnology》上。

**主要关键技术与方法**

研究人员以大肠杆菌（*E. coli*）来源的FSA为研究对象，采用QM/MM计算结合增强采样（Well-Tempered Meta-eABF）方法解析催化机制；利用全原子分子动力学（MD）模拟分析蛋白动态；通过结构引导的定点饱和突变和组合突变获得高活性变体；利用HPLC进行产物定量。在体外多酶级联系统中，研究人员使用甲醇氧化酶（AOX）、过氧化氢酶、甲醛酶突变体（FLS-M3）、二羟基丙酮激酶（PpDhaK）、多聚磷酸激酶（PPK）、磷酸丙糖异构酶（EcTPI）、果糖-6-磷酸磷酸酶突变体（F6PP3）、甘露醇脱氢酶（LpMDH）和甲酸脱氢酶（MvFDH）等酶，构建了从甲醇到甘露醇的两步级联反应。

**研究结果**

**3.1 FSA中供体激活的潜在反应机制**
通过QM/MM模拟，研究人员构建了DHA和GALP醛醇反应的逐步自由能曲线和过渡态结构。结果显示，供体激活过程中，脱水步骤（从羧醇胺到亚胺离子的转化）是供体激活模块内的限速步骤，自由能垒约为24 kcal/mol。亚胺离子随后通过α-去质子化形成亲核烯胺中间体，该过程能垒较低且热力学有利。

**3.2 FSA中受体添加和产物释放的反应机制**
在受体添加阶段，烯胺的C₃攻击GALP的醛基碳（C₄），形成C–C键的能垒为8.7 kcal/mol。随后，离去水分子对亚胺离子进行水合生成六碳羧醇胺中间体，能垒10.7 kcal/mol。产物释放的关键步骤是Tyr131向Lys85的Nζ提供质子，促进C–N键断裂，能垒18.2 kcal/mol；最后C₂羰基恢复，产物F6P释放。

**3.3 理性设计FSA以提高活性**
基于供体激活机制，研究人员聚焦于供体口袋残基Asn28、Thr109和Ala129进行定点饱和突变。其中，A129S（M1）突变体活性显著提高，纯化酶比活力达12.5 U/mg，较野生型提高21倍。QM/MM MD模拟表明A129S可能通过增强局部氢键网络促进脱水步骤。随后，针对受体结合区的第二壳层残基（Ser30、Ser166、Lys168）进行饱和突变，发现M1-K168R（M2）比活力进一步增加34%。

**3.4 组合突变提高催化效率**
将S30T、S30H、S30E与K168R、K168S、K168H在M1背景上组合，筛选得到三突变体M3-3（A129S/S30T/K168R），纯化酶比活力达20.4 U/mg，催化效率较野生型提高34倍。动力学分析显示M3-3对GALP的K_m降至0.6 mM。隧道分析和自由能计算表明，S30T可能优化GALP进入通道的方向，K168R通过增强正电荷与磷酸基团静电相互作用稳定底物结合。

**3.5 工程化FSA用于一碳转化为甘露醇**
研究人员设计了将甲醇转化为甘露醇的体外多酶级联系统，分为C1-to-C3模块（甲醇→甲醛→DHA）和C3-to-C6模块（DHA→F6P→果糖→甘露醇）。在C3-to-C6模块优化中，使用M3-3变体，最佳酶负载和聚磷酸浓度下，以200 mM DHA为底物时甘露醇产量达80 mM，转化率80.3%；M3-3酶用量较先前研究降低3倍。最终，两阶段级联反应以200 mM甲醇为底物，在约4小时C1-to-C3转化后加入C3-to-C6酶组分，甘露醇积累至29.8 mM，转化率88.8%。

**总结与翻译结论**

本研究通过QM/MM模拟结合增强采样，阐明了FSA介导的DHA与GALP醛醇反应的催化循环，提供了供体激活、受体添加和产物释放的机制解释。基于反应机制，研究人员理性工程化了FSA以提高其催化性能，获得了多个有益突变体，其催化效率较野生型FSA提高34倍。最终，研究人员将工程化FSA整合到一个设计的体外生物转化平台中用于一碳转化，展示了其在构建高效甘露醇合成路线中的实用性。总之，这项工作为醛缩酶工程建立了基于机制的框架，并支持可扩展的一碳增值合成途径的开发。