使用大宗化学品己内酰胺为原料的1,6-己二胺合成的无细胞系统

《Synthetic and Systems Biotechnology》：A cell-free system for 1,6-hexanediamine synthesis using bulk chemical caprolactam as the feedstock

　　

生物制造凭借其温和、低碳排放和可再生等优势，推动了绿色化学和可持续发展的前沿。然而，复杂的代谢途径和胞内资源竞争常常限制了代谢工程方法的效率和产量，特别是对于非天然化合物，如作为尼龙66重要前体的1,6-己二胺（1,6-HMD）。为了应对这些挑战，研究人员开发了一种无细胞生物催化系统，采用源自低成本己内酰胺的6-氨基己酸（6-ACA），并结合优化的酶组装和辅因子再生策略。结果，1,6-己二胺的滴度提高了511倍，达到创纪录的10.35 g/L，转化率为97.4%。该系统进一步扩展应用于C7–C10 α,ω-二胺的生产，实现了高水平滴度。此外，该无细胞生物催化系统在4 °C储存7天后仍保持显著的活性，滴度仅下降25.9%。这种无细胞生物催化克服了生物系统的固有局限性，并保留了酶活性，展示了高效合成二胺的巨大潜力，并表明其在实际应用中的广泛适用性。

论文解读文章

研究背景：传统生物制造虽具有温和、低碳和可再生优势，但复杂代谢途径和胞内资源竞争严重限制了代谢工程方法的效率，尤其对非天然化合物如1,6-己二胺（1,6-HMD）——尼龙66关键前体——的生产。工业上由己二腈加氢制1,6-HMD的方法剧毒且设备要求高，现有生物法（如大肠杆菌工程菌）因产物积累和中间体毒性导致产量极低。为突破细胞膜屏障、避免代谢负担并提高产量，研究人员利用低成本大宗化学品己内酰胺（CPL）水解获得的6-氨基己酸（6-ACA）为底物，开发一种无细胞生物催化系统。通过酶组件筛选、辅因子再生和系统优化，实现了1,6-HMD的创纪录高产，并拓展至C7–C10 α,ω-二胺的合成，展示出工业化潜力。该论文发表在《Synthetic and Systems Biotechnology》期刊。

主要关键技术方法：研究人员构建了无细胞催化系统，采用双细胞表达体系分别生产羧酸还原酶MAB CAR^L342E（催化6-ACA还原）和转氨酶HATA（催化胺化），并以粗酶液直接催化。辅因子再生方面，引入多聚磷酸激酶PPK12（利用多聚磷酸polyP₆再生ATP）和葡萄糖脱氢酶BmGDH（利用葡萄糖再生NADPH）。通过筛选七种转氨酶选定HATA，并评估系统在4°C储存7天后的稳定性。所有酶均在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，未使用纯化酶，降低成本。

研究结果：
1. **人工1,6-HMD途径的构建**：以6-ACA为底物，在大肠杆菌中表达MAB CAR^L342E和转氨酶SPTA，构建工程菌HMD1，摇瓶发酵仅产20.2 mg/L 1,6-HMD。基于该途径开发全细胞催化系统，产量提升至101.9 mg/L；添加0.07%十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）透化细胞后，产量增至583.0 mg/L，但转化率仅5.5%，表明细胞膜仍限制产物外排。
2. **无细胞平台的设计**：比较双质粒、串联和双细胞三种表达模式的无细胞催化，双细胞系统表现最佳，产量达3.6 g/L，为全细胞催化的5.2倍。双细胞系统通过分离代谢功能降低了单个细胞的代谢负荷，实现了更高效的资源分配。
3. **改进转氨酶的筛选**：在无细胞系统中测试七种转氨酶，HATA表现最优，产量达8.0 g/L，为SPTA的2.2倍。动力学分析显示HATA的催化效率（k_cat/K_m = 0.34 × 10³ M^?1 s^?1）比SPTA（0.21 × 10³ M^?1 s^?1）高1.6倍，主要归因于更强的底物亲和力。
4. **无细胞系统优化与性能评估**：引入NADPH和ATP再生系统后，在葡萄糖补充条件下反应10小时，1,6-HMD产量达到10.35 g/L，转化率为97.4%，比摇瓶发酵提高511.4倍，比全细胞催化提高16.8倍。粗酶在4°C储存7天后产量仅下降25.9%，表明良好的稳定性。经脱盐-萃取-精馏纯化，1,6-HMD纯度达97.2%。
5. **无细胞系统应用合成中链α,ω-二胺**：将系统拓展至C7–C10 ω-氨基脂肪酸，分别得到1,7-庚二胺（10.58 g/L，产率81.4%）、1,8-辛二胺（6.45 g/L，44.8%）、1,9-壬二胺（2.17 g/L，58.7%）和1,10-癸二胺（5.09 g/L，29.6%）。HATA对C6底物催化效率最高，较长链底物因空间位阻和奇偶碳链效应效率降低。

总结讨论：该无细胞系统在粗酶水平上实现了与纯酶体系相当甚至更高的产量（10.35 g/L vs. 纯酶体系9.58 g/L），且成本更低。通过酶组分适配（选用HATA）和辅因子再生，克服了细胞膜运输限制和中间体毒性，并保持酶活性。系统在4°C储存7天仍具活性，简化了保存流程。此外，该系统可高效合成不同链长的α,ω-二胺，展示了广泛适用性。

研究结论部分翻译：总之，研究人员开发了一种高效的无细胞生物催化方法，用于高产合成1,6-己二胺（1,6-HMD）。利用来自低成本且大量生产的工业原料己内酰胺（CPL）所衍生的6-氨基己酸（6-ACA）作为底物，通过酶组分的适配和辅因子策略的优化，实现了创纪录的10.35 g/L滴度和97.4%的产率。此外，该系统成功应用于生产α,ω-二胺，获得了高水平滴度，其中1,7-庚二胺、1,8-辛二胺、1,9-壬二胺和1,10-癸二胺的转化率尤为显著。这些结果表明，该无细胞生物催化系统在高效合成中链二胺及其他化学品方面具有巨大潜力。