大肠杆菌系统工程用于高水平羟基酪醇生产

《Synthetic and Systems Biotechnology》：Systems engineering of Escherichia coli for high-level hydroxytyrosol production

　　

羟基酪醇（HT）是一种强效的多酚类抗氧化剂，广泛应用于生物医药和食品工业。然而，其高水平微生物合成主要受到代谢通量失衡和严重细胞毒性的阻碍。在本研究中，研究人员在一个工程化的产L-苯丙氨酸大肠杆菌（E. coli）底盘菌中构建了一条从4-羟基苯丙酮酸（4-HPP）出发的人工合成途径。在此基础上，通过针对aroK、aroC和tyrA的启动子工程加强内源性前体供应，并通过过表达ARO10增强异源HT生物合成途径。为缓解中间产物L-多巴（l-DOPA）积累，共表达L-多巴脱羧酶（DODC）和酪胺氧化酶（TYO）使L-多巴减少了63.7%，而表达L-氨基酸脱氨酶（LAAD）使L-多巴减少了76.1%。此外，研究人员实施了精准的辅因子工程：过表达核黄素代谢基因ribH、ribC和ribF，同时引入pntAB，分别使HT产量提高了30.9%和12.7%。进一步地，在HT胁迫下的转录组分析揭示了与转运和应激反应相关的基因显著上调。在这些靶点中，过表达marR显著提高了细胞耐受性和HT产量。最终，在补充Fe²⁺和抗坏血酸的5-L生物反应器发酵中，工程菌株达到了9.25 g/L的HT滴度、0.102 g/g葡萄糖的得率和0.193 g/L/h的生产率。该研究报道了迄今为止以葡萄糖为碳源在大肠杆菌中获得的最高HT滴度，为稳健的生物制造平台提供了基础。

**论文解读文章**

**研究背景**

羟基酪醇（HT）是一种强效的多酚类抗氧化剂，因其抗氧化、抗炎、抗菌和抗癌特性，在功能食品、药物制剂和高端化妆品领域具有广泛应用前景，预计到2030年市场规模将接近25亿美元。目前HT的主要生产方式包括植物提取、化学合成和微生物发酵。传统植物提取依赖橄榄资源，存在区域依赖性强、提取效率低、环境影响大及原料供应不稳定等缺点；化学合成则常使用危险试剂和剧烈反应条件，限制了其规模化生产和绿色发展。相比之下，微生物合成具有反应条件温和、过程可控、可持续性好等优势，被视为HT高效生物制造的理想策略。

然而，HT的微生物从头合成面临四大瓶颈：前体供应不足、关键酶催化活性低、反馈抑制以及HT本身的细胞毒性。尽管已有在大肠杆菌（E. coli）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）等地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）中实现HT合成的报道，但产量、产率和发酵周期仍有较大提升空间。其中，大肠杆菌因其遗传操作简便、代谢网络清晰、生长迅速及碳源利用广泛等优势，被认为是HT生产的适宜宿主。先前研究通过代谢工程策略（如敲除ptsG和pykA增加磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）供应、对HpaBC进行定点突变提高催化活性、解除aroG和tyrA的反馈抑制等）提升了HT产量，但大规模发酵过程的迭代优化仍需进一步加强，以满足工业化生产需求。

为此，研究人员在前期构建的L-苯丙氨酸生产菌株E. coli JNYPQ基础上，系统地应用代谢工程策略，旨在解决前体供应、副产物积累、辅因子平衡、菌株耐受性和发酵工艺等关键问题，实现HT的高效生物合成。该研究发表在《Synthetic and Systems Biotechnology》上。

**主要关键技术方法**

研究人员采用以下关键技术方法开展研究：（1）利用CRISPR/Cas9编辑系统进行基因整合与敲除；（2）通过不同强度启动子（PJ23119、PJ23105、PJ23115）进行基因表达精细调控；（3）使用不同拷贝数质粒（pRSFDuet、pETDuet等）表达合成模块；（4）基于全细胞催化评估异源酶活性；（5）运用高通量RNA-seq进行转录组分析，鉴定HT胁迫下的差异表达基因；（6）在5L发酵罐中进行补料分批发酵，优化接种量、诱导时机及Fe²⁺和抗坏血酸添加量。所有菌株均以E. coli JNYPQ（来源：实验室构建的L-苯丙氨酸生产菌，保藏号GDMCC No. 62245）为底盘。

**研究结果**

**3.1 构建从头合成羟基酪醇的菌株**
通过筛选来自不同来源的4-羟基苯乙酸3-单加氧酶（HpaBC）、苯丙酮酸脱羧酶（ARO10）和醇脱氢酶（ADH6），选定大肠杆菌BL21源的HpaBC、酿酒酵母源的ARO10和ADH6组合。利用高拷贝质粒pRSFDuet-1表达合成模块，菌株HT04在摇瓶中产HT 122 mg/L。敲除编码分支酸变位酶的pheA后，细胞生长严重受抑，添加1.2 g/L苯丙氨酸后HT产量升至150 mg/L，但积累985 mg/L莽草酸，表明内源性前体供应不足。

**3.2 羟基酪醇代谢途径工程**
在基因组中过表达莽草酸激酶（aroK）、分支酸合酶（aroC）和预苯酸脱水酶突变体（tyrA1），HT产量分别提高至265、258和327 mg/L，莽草酸积累显著降低。通过启动子工程优化三种基因的组合表达，菌株HT11-12（aroK中表达、aroC中表达、tyrA1高表达）摇瓶HT产量达533 mg/L，整合至基因组后菌株HT12产525 mg/L，莽草酸降至112 mg/L。敲除pykA（编码丙酮酸激酶）和feaB（编码苯乙醛脱氢酶）后，HT产量分别提升至620和703 mg/L；而敲除mhpB（编码3-羟基苯丙酸降解酶）未显著提高产量。

**3.3 羟基酪醇合成模块优化**
使用组成型启动子PJ23119过表达ARO10，HT产量升至880 mg/L，证实ARO10为合成模块的关键酶。将ARO10替换为催化效率更高的突变体ARO10^D331C后，菌株HT19产HT 984 mg/L。但发酵液中积累987 mg/L L-多巴（l-DOPA），该副产物来源于ARO10和HpaBC的底物混杂性。为减少l-DOPA积累，引入L-多巴脱羧酶（DODC）和酪胺氧化酶（TYO）共表达，HT产量1.05 g/L；引入L-氨基酸脱氨酶（LAAD）则使产量升至1.26 g/L，残留l-DOPA降至236 mg/L，且LAAD还能氧化酪氨酸增加前体供给。

**3.4 辅因子工程优化羟基酪醇合成**
外源添加核黄素（20 mg/L）使HT产量提升107.9%至2.62 g/L。过表达核黄素生物合成基因ribH、ribC和ribF，HT产量提高30.9%至1.65 g/L。进一步引入吡啶核苷酸转氢酶基因pntAB（增强NADPH供应），HT产量再增12.7%至1.86 g/L；而过表达酿酒酵母NADH激酶Pos5P或大肠杆菌NAD⁺激酶nadK效果不显著；引入葡萄糖脱氢酶（GDH）或过表达葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（zwf）反而降低产量，并导致NADPH/NADP⁺比无显著提高。

**3.5 羟基酪醇耐受靶点筛选与评估**
转录组分析显示，在3 g/L HT胁迫下，HT29菌株有103个基因显著上调、64个显著下调，主要涉及转运、铁载体、鞭毛合成和应激反应。从中选取8个上调倍数>2的基因（malG、marR、cbl、iscR、dctR、galS、malF、lgoR）进行过表达验证。在3 g/L HT胁迫下，过表达marR和cbl使菌株生长分别提高28.9%和13.8%；摇瓶发酵中，过表达marR使HT产量达2.18 g/L，较对照提高17.2%，且细胞死亡率降低。

**3.6 发酵优化**
在5L发酵罐中，优化接种量为4%、诱导时机为OD₆₀₀=25。添加40 mg/L Fe²⁺和2 g/L抗坏血酸后，菌株HT29-2以葡萄糖为碳源发酵48 h，HT滴度达9.25 g/L，得率0.102 g/g葡萄糖，产率0.193 g/L/h。改用甘油为碳源时，HT产量降至7.76 g/L，得率0.081 g/g，但生物量增加。

**总结讨论与结论**

讨论部分指出，本研究通过系统代谢工程策略实现了大肠杆菌中羟基酪醇（HT）的高效合成。通过多基因组合调控与启动子工程优化前体供给，阻断竞争分支，显著提高前体可用性；利用转录组测序鉴定出关键耐受调控基因marR；通过辅因子再生与发酵稳定性的协同优化，最终工程菌株在5L发酵罐中48 h内产生9.25 g/L HT，为目前该合成途径的最高滴度。研究同时解决了前体代谢竞争、辅因子供需失衡和产物毒性胁迫等关键瓶颈，为HT工业生物制造提供了经济可行的技术方案。未来可聚焦于：通过基因组筛选或适应性进化开发高HT耐受菌株；优化大规模发酵工艺；构建合成酶支架或融合蛋白改善底物通道效应；结合原位产物分离技术降低产物抑制。

结论部分（原文翻译）：在本研究中，通过筛选羟基酪醇生物合成途径中的酶并引入相应的合成途径，获得了高产羟基酪醇的大肠杆菌菌株。为阻止碳通量损失，去除了分支途径并提高了前体供应。增加了途径酶的拷贝数，并替换了关键限速酶。由于中间副产物L-多巴的积累导致代谢流显著损失，引入了L-氨基酸脱氨酶（LAAD）将L-多巴转化为终产物。过表达ribHCF和pntAB增强了FAD和NADPH的可用性，从而提高了羟基酪醇的生成。转录组研究表明，过表达marR对于提高工程菌株的耐受性和羟基酪醇产量至关重要。以葡萄糖为碳源在5L发酵罐中经48 h发酵，羟基酪醇滴度达到9.25 g/L，葡萄糖转化率为10.2%，为工业化规模生产提供了新数据。