利用抗体-适配体夹心法的微流控荧光生物传感器用于定量检测血清中HER2

《Talanta》：Microfluidic fluorescence biosensor for quantitative detection of HER2 in serum using an antibody–aptamer sandwich assay

　　

早期检测癌症生物标志物需要能够在复杂生物基质中进行灵敏定量分析的分析平台。研究人员在此报道了一种微流控荧光生物传感器，用于定量检测人血清中的乳腺癌生物标志物人表皮生长因子受体2（HER2）。该系统将混合珠基抗体-适配体夹心法与薄膜氢化非晶硅（a-Si:H）光电二极管及介质干涉滤光片相结合，在完全集成的微流控架构中实现紧凑型片上荧光检测。蛋白G功能化微珠实现了捕获抗体的定向固定，而荧光标记的HER2适配体作为检测探针，形成混合抗体-适配体识别方案，最大限度地减少了血清基质中的非特异性相互作用。优化了微流控结构和洗涤方向，以抑制残留的未结合适配体，显著提高了信噪比。在优化条件下，该生物传感器在90%人血清中对临床相关水平的HER2浓度表现出近线性荧光响应，检测限（LOD）达到7–8 ng mL^-1，低于15 ng mL^-1的临床阈值。光电二极管测量结果与荧光显微镜一致，证实了可靠的片上信号采集。这些结果展示了一种可扩展的策略，将混合分子识别、微流控背景抑制和集成薄膜光电检测结合在一个紧凑的荧光生物传感平台中，用于定量生物标志物分析。

**论文解读：基于微流控荧光生物传感器的血清HER2定量检测**

**研究背景与意义**
癌症是全球主要死亡原因之一，早期检测可显著改善治疗预后，但早期症状常不典型，导致诊断延迟。基于血液的生物标志物检测（液体活检）作为微创、经济的筛查手段备受关注。人表皮生长因子受体2（HER2）在相当比例的乳腺癌中过表达，是重要的诊断和治疗靶点，其血清浓度阈值约15 ng mL^-1，因此精准定量HER2具有高度临床相关性。传统酶联免疫吸附试验（ELISA）依赖抗体，存在批次间变异、储存不稳定及非特异性结合导致背景信号偏高的问题。适配体作为单链DNA/RNA寡核苷酸，具有化学稳定性高、易化学修饰及在复杂基质中非特异性吸附低的优势，为构建高灵敏生物传感平台提供了新思路。然而，现有HER2生物传感器常依赖外部光学设备或笨重的检测模块，限制了便携化和集成化发展。为此，研究人员设计了一种集成微流控、薄膜光电检测和混合分子识别的紧凑型荧光生物传感平台，旨在实现血清中HER2的灵敏、定量、片上检测。研究发表在《Talanta》。

**关键技术与方法**
研究人员整合了以下核心技术：(1) 微流控芯片设计，包含20 μm高连接通道和100 μm高的微珠捕获室，用于容纳蛋白G功能化琼脂糖微珠（直径40–90 μm），并实现定向抗体固定与试剂流控；(2) 混合抗体-适配体夹心法，以抗HER2捕获抗体固定于蛋白G微珠，荧光标记（ATTO）HER2适配体作为检测探针，降低非特异性吸附；(3) 介质干涉滤光片（分布式布拉格反射镜，DBR），由交替的氮化硅（SiN_x）和二氧化硅（SiO₂）层构成，阻断488 nm激发光并透射505 nm发射光；(4) 薄膜氢化非晶硅（a-Si:H）p-i-n光电二极管，主动区200 μm × 200 μm，集成于玻璃基底，实现片上荧光电流检测。所有实验在90%人血清中进行，无特定临床队列样本。

**主要研究结果**

**1. 集成生物传感平台架构**
通过垂直堆叠设计，将微流控微珠室、介质滤光片和薄膜光电二极管对齐整合，实现紧凑型荧光检测。蛋白G微珠定向固定捕获抗体，荧光适配体作为检测探针，形成混合夹心构型。微流控几何结构与洗涤方向被联合优化以抑制未结合荧光探针的背景信号。研究表明，该架构在不依赖外部显微镜的条件下即可完成片上信号采集。

**2. 检测优化与背景抑制策略**
通过优化关键参数（适配体浓度5 μM、封闭液1 mg/mL IgG、TE缓冲液），并系统评估洗涤流速、持续时间及入口选择，发现标准试剂入口洗涤方式导致微珠室底部区域残留未结合适配体，显著增加背景。改为从微珠填充入口以2.5 μL/min洗涤5分钟后，背景信号显著降低，使0与25 ng/mL HER2的荧光信号比率在PBS和90%人血清中均保持高质量。结论：优化洗涤方向是提升信噪比的核心环节。

**3. 血清中的分析性能**
在90%人血清中构建HER2浓度（0–25 ng/mL）的校准曲线，荧光强度与HER2浓度呈近似线性关系，涵盖临床相关范围（阴影区域）。检测限（LOD，基于空白三倍标准差计算）为7–8 ng mL^-1，低于临床阈值15 ng mL^-1。检测范围为5–25 ng/mL，高于此浓度未测试（已显著超过临床相关范围）。该结果表明平台在复杂血清基质中可实现临床级灵敏度。

**4. 集成薄膜光电二极管验证**
将优化后的检测流程转移至片上集成系统，使用a-Si:H光电二极管替代显微镜读值。在90%人血清中，0 ng/mL HER2的光电流与暗电流无差异，表明洗涤与滤光有效抑制背景；25 ng/mL HER2则产生明确可重复的光电流增加，且增加幅度与荧光显微镜测量结果一致。光电二极管暗电流约10^-13 A（~10^-10 A cm^-2），噪声等效功率（NEP）约6×10^-14 W，比探测率（D*）约10¹¹ Jones。结论：集成薄膜光电检测可保持与显微镜相当的灵敏度，支持片上定量。

**5. 与现有HER2生物传感器的比较**
对比文献中电化学、光学（SPR）、荧光等平台（如金纳米粒子修饰电极、MOF基荧光传感器），本平台独特之处在于：(1) 使用混合抗体-适配体识别以兼顾亲和力和低非特异性；(2) 集成a-Si:H光电二极管实现片上检测，无需外部光学仪器；(3) 全微流控架构兼容可扩展制造。尽管部分电化学传感器检测限更低（如fg/mL级别），但这些平台通常需要外部电化学工作站，且多在缓冲液中进行。本平台在90%人血清中实现临床相关灵敏度，架构紧凑，适合即时检测（POC）场景。

**总结与讨论**
研究人员通过共设计分子识别化学、微流控洗涤架构和薄膜光电探测器，实现了低背景荧光传感。所构建的微流控荧光适配体传感器能特异性检测HER2，在血清中表现出良好选择性，线性范围覆盖临床阈值，LOD达7–8 ng mL^-1。集成薄膜光电二极管的验证实验证明片上读取的可行性，信号趋势与显微镜一致。讨论部分指出，虽然当前平台为单次使用设计（避免交叉污染），其PDMS微流控架构可转向热塑性材料注塑成型，a-Si:H光电二极管兼容大面积半导体工艺，具备规模化潜力。未来需进一步整合流体驱动、控制电子和激发源以实现全自动分析，并采用患者样本验证临床转化价值。

**结论部分翻译**：
本工作的核心创新在于分子识别化学、微流控洗涤架构和薄膜光电探测器的一体化协同设计，从而在紧凑分析平台中实现低背景荧光传感。研究人员开发并实现了一种基于荧光的适配体检测方法，用于检测HER2蛋白，并集成于微流控传感平台。该系统将HER2靶向适配体的高特异性与荧光信号调制相结合，在确定的线性范围内实现低检测限的灵敏检测。该检测方法在非靶蛋白存在下对HER2也表现出良好选择性。将传感策略整合入微流控格式，实现了对微量样本的受控操作，并为在良好定义条件下进行检测提供了便利平台。这种集成方法凸显了将适配体分子识别与微流控技术相结合以开发紧凑、高效蛋白检测分析系统的潜力。尽管本研究在复杂血清基质中展示了分析性能，未来工作将集中于使用临床患者样本和更大队列进行验证，以进一步评估平台的转化潜力。总体而言，该平台为HER2传感提供了一种有前景的策略，并展示了集成微流控-荧光方法用于生物标志物分析的潜力。尽管完全自主的即时检测实施仍需进一步工程整合，但所展示的架构与可扩展的微流控和薄膜半导体制造策略兼容。本研究所实现的混合抗体-适配体识别、工程化微流控处理和薄膜荧光检测的集成，为紧凑且可能实现多重检测的生物标志物传感平台提供了可扩展框架。