《Talanta》：High-efficiency label-free separation of natural killer cells via size-selective cell clustering in optimized contraction–expansion array microfluidic device
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高效、高纯度地分离免疫细胞是下游免疫学分析和基于细胞测定（cell-based assays）的关键前提。然而，传统的无标记分离方法（如密度梯度离心）受限于较长的处理时间和欠佳的分离效率。为解决这些问题，研究人员提出了一种收缩-膨胀阵列（contraction
高效、高纯度地分离免疫细胞是下游免疫学分析和基于细胞测定（cell-based assays）的关键前提。然而，传统的无标记分离方法（如密度梯度离心）受限于较长的处理时间和欠佳的分离效率。为解决这些问题，研究人员提出了一种收缩-膨胀阵列（contraction–expansion array, CEA）微流控装置，通过几何介导的流体动力学调控，从血液样本中无标记分离自然杀伤（natural killer, NK）细胞。微通道设计包含具有方形或六边形膨胀区域的收缩-膨胀阵列，并结合75或100 μm的收缩宽度，能够精确调控惯性升力（inertial lift force）和Dean拖曳力（Dean drag force），诱导尺寸依赖性颗粒迁移和分离。研究人员使用COMSOL Multiphysics进行数值模拟，分析流场分布和颗粒迁移行为。使用10和20 μm聚苯乙烯颗粒进行的实验验证显示，与模拟结果高度一致，确认了数值模型的有效性。优化后的装置采用六边形膨胀区域和100 μm收缩宽度，在125 μL/min流速下，对10 μm颗粒实现了83.8%的回收率（recovery rate）和97.1%的纯度（purity）。为解决实际血液检测中细胞尺寸分布重叠的挑战，研究人员采用了一种选择性细胞聚类试剂，将非NK细胞和红细胞聚集为更大的团簇，从而增强基于尺寸的分离。该装置实现了70.9%的NK细胞回收率、91.2%的纯度以及95.3%的活性（viability）。总体而言，所提出的装置为NK细胞分离提供了一个高通量、无标记且生物相容的平台，在整合至癌症免疫治疗和临床诊断工作流程方面具有巨大潜力。
**研究背景与问题**
自然杀伤细胞（NK细胞）是先天免疫系统的关键效应细胞，无需预先抗原呈递或主要组织相容性复合体（MHC）限制即可快速识别并清除感染或恶性细胞，在抗肿瘤免疫中具有独特优势。然而，肿瘤微环境（TME）中存在的抑制因子（如TGF-β、低氧）和免疫抑制细胞群会削弱NK细胞功能。因此，基于NK细胞的过继性输注、嵌合抗原受体工程化NK细胞（CAR-NK）等治疗策略正被积极开发，这亟需高纯度、低损伤且可集成的NK细胞分离平台。当前主流的细胞分离技术包括荧光激活细胞分选（FACS）、磁激活细胞分选（MACS）和密度梯度离心。FACS虽灵敏特异，但成本高、操作复杂，荧光标记可能影响细胞活性和功能分析；MACS通量较高但对稀有细胞（<1%）分离灵敏度不足；密度梯度离心虽无需标记，但当目标细胞与其他细胞密度相似时准确性下降。因此，需发展结合高纯度、高效率且对细胞完整性影响最小的替代分离方法。
**研究内容与结论**
研究人员系统优化了基于收缩-膨胀阵列（CEA）的微流控装置，用于从全血中无标记分离NK细胞。通过数值模拟（COMSOL Multiphysics）和实验验证，确定六边形膨胀区域结合100 μm收缩宽度的Hex-W配置为最优设计，该构型能平衡惯性升力和Dean拖曳力，实现尺寸依赖的颗粒迁移与分离。采用选择性细胞聚类试剂放大NK细胞与非目标细胞（非NK细胞和红细胞）之间的尺寸差异，克服了实际血液样本中细胞尺寸分布重叠的挑战。实验结果显示，该装置对10 μm聚苯乙烯颗粒的回收率达83.8%、纯度达97.1%；对人外周血NK细胞的回收率为70.9%、纯度为91.2%，且细胞存活率高达95.3%。本研究提供了一种高通量、无标记、生物相容的NK细胞分离平台，对推动癌症免疫治疗和临床诊断工作流程具有重要价值。该论文发表在《Talanta》期刊。
**关键技术与方法**
研究人员主要采用以下关键技术方法：1）数值模拟：使用COMSOL Multiphysics软件对四种通道几何构型（方形或六边形膨胀区域，结合75或100 μm收缩宽度）进行流场分布和颗粒迁移行为分析；2）微流控装置设计与制备：基于标准软光刻技术制造聚二甲基硅氧烷（PDMS）微通道，通道深度50 μm，包含50个均匀间隔的CEA单元，总长35 mm；3）实验验证：先后使用10和20 μm聚苯乙烯颗粒以及人外周血样本进行分离性能评估，样本来源于人类志愿者的外周血；4）选择性细胞聚类试剂：采用商业化试剂将非NK细胞和红细胞聚集为更大团簇，以扩大与NK细胞（典型直径约10 μm）的尺寸差异，实现基于惯性聚焦的高效分离。
**研究结果**
（1）收敛性分析（Convergence analysis）：针对Hex-W构型，在125 μL/min流速下，通过六种逐步细化的网格密度监测最终收缩处的平均流速，发现网格数超过4.6×10
5时流速变化小于1%，确认网格独立性，最终选择500,693个单元用于模拟。
（2）膨胀几何形状和收缩宽度的影响（Effect of expansion geometry and contraction width）：模拟结果显示，六边形膨胀区域能产生更强的Dean涡，促进颗粒向通道侧壁迁移；收缩宽度越窄，惯性升力梯度越大，颗粒聚焦更集中。通过对比出口处10和20 μm颗粒的横向偏移位移，Hex-W构型（六边形、100 μm收缩宽度）在125 μL/min下实现了最大的尺寸分离度（两颗粒中心偏移差值最大）。
（3）聚苯乙烯颗粒分离（Separation of polystyrene particles）：实验验证采用10和20 μm聚苯乙烯颗粒，在Hex-W装置、125 μL/min流速下，10 μm颗粒回收率达83.8%、纯度97.1%；20 μm颗粒回收率与纯度略低（主要因部分大颗粒停留在顶部出口），但整体与模拟结果高度一致，证实了数值模型的有效性。
（4）外周血中NK细胞分离（Isolation of NK cells from peripheral blood）：对全血样本进行选择性细胞聚类预处理后，NK细胞（平均直径约10 μm）因尺寸小于聚集后的非NK细胞团簇（直径>20 μm），在Hex-W装置中经惯性聚焦迁移至不同出口。流式细胞术分析表明，NK细胞回收率达70.9%，纯度91.2%，存活率95.3%。与未经聚类处理相比，纯度和回收率均显著提升，证明了该方法克服尺寸重叠问题的有效性。
**讨论与结论**
讨论部分指出，该CEA装置通过几何优化实现了高精度尺寸分离，选择性细胞聚类试剂有效避免了细胞尺寸重叠导致的分离效率下降。与传统方法相比，该平台无需荧光或磁性标记、操作简单、通量高（125 μL/min），且细胞存活率超过95%，表明其生物相容性良好。研究人员认为，该平台可进一步集成至免疫细胞功能分析、CAR-NK细胞制备等下游应用，在癌症免疫治疗和临床诊断中具有广泛前景。
研究结论：本研究开发并验证了一种优化的CEA微流控平台，用于血液样本中自然杀伤（NK）细胞的高效无标记分离。通过使用COMSOL Multiphysics对四种通道几何构型进行系统分析，Hex-W配置（六边形膨胀区域结合100 μm收缩宽度）被确定为最佳设计，该构型能够在通道内平衡惯性升力和Dean拖曳力，从而产生尺寸依赖的侧向迁移。使用10和20 μm聚苯乙烯颗粒进行的实验验证表明，该装置在前述流速下对10 μm颗粒实现了83.8%的回收率和97.1%的纯度。为解决外周血NK细胞分离中细胞尺寸分布重叠的挑战，研究人员应用了一种选择性细胞聚类试剂，将非NK细胞和红细胞聚集为更大的团簇，从而放大了与NK细胞之间的尺寸差异。在经过处理的血液样本中，该装置实现了70.9%的NK细胞回收率、91.2%的纯度以及95.3%的细胞活性。总体而言，该CEA平台提供了一种高通量、无标记且生物相容的NK细胞分离方案，在整合至癌症免疫治疗和临床诊断工作流程方面展现出巨大潜力。
