综述：铱(III)配合物的DNA结合特性：涵盖设计、功能与生物物理评估

《ChemPhysChem》：DNA-Binding Properties of Iridium(III) Complexes Encompassing Design, Function and Biophysical Assessments

　　

近年来，铱(III)配合物在生物领域的应用日益多元化，从发光细胞成像剂到治疗及前瞻性诊疗一体化（theranostics）试剂的开发，均得益于创新性的配体设计与可调谐的光物理性质。在此生物学背景下，理解分子探针如何与生物底物及大分子相互作用至关重要。本综述聚焦于基于铱(III)的金属配合物在DNA结合方面的结构多样性，总结了用于探究这些配合物与DNA相互作用的通用工作流程，并批判性分析了配合物结构与功能之间的关系。

1 引言

金属-配体配位配合物与脱氧核糖核酸（DNA）相互作用的本质已历经数十年研究。从对分子相互作用精确描述的基础研究，到可控甚至利用此类相互作用的应用领域，金属配合物持续为化学与生物学科的研究人员提供独特机遇。过往二十年已有大量综述从不同角度论述金属配合物与DNA的相互作用，而金属配合物因不同金属离子与配体组合所提供的结构可控性与多样性尤为引人关注。正电荷、空间与几何构型调控、平面疏水配体区域的使用以及可解离配体位点均可被设计以促进不同类型的DNA相互作用。可调谐的氧化还原特性、光学与发光性质同样为研究和表征DNA相互作用的性质提供了多种途径。金属配合物与DNA的结合模式可分为可逆与不可逆两类，后者通常涉及共价键形成（具体为金属离子与DNA之间的配位键），一般意味着金属中心的配体取代（如顺铂中氯配体的水解促进其与DNA内嘌呤碱基的配位）；可逆DNA结合通常为非共价作用，包含静电结合、嵌入（intercalation）与沟槽（主/次沟槽）结合模式。鉴于该主题已有大量全面综述，本文聚焦于两个方向：一是概述用于探究分子与DNA相互作用的前沿技术；二是阐述不同结构铱(III)配位配合物作为DNA结合剂的实用价值。

2 铱(III)配合物的生物适用性

金属基化合物长期以来推动医学进步，既可作为治疗药物（如靶向DNA化疗的顺铂），也可用于磁共振成像与放射成像的诊断，或作为荧光显微镜的细胞成像剂，最终发展为智能诊疗一体化试剂。在此背景下，铱(III)配合物（尤其是最常见的有机金属变体）受到显著关注。多种铱(III)配合物因结构易调谐性（通过配体修饰）、能够以选择性可控的方式与DNA结合，以及其光致发光性质，成为极具潜力的候选体系。目前研究主要涉及三类铱(III)配合物：半夹心“钢琴凳”（piano stool）铱(III)配合物、八面体多吡啶配合物与八面体环金属化铱(III)物种。不同类别分子的性质与反应活性差异决定了其生物应用场景：“钢琴凳”类多集中于细胞毒性与抗癌活性研究，但通常缺乏可用于无创光学成像实验的光物理属性；而八面体环金属化物种因优异的发光性质与光稳定性，被广泛用于光学成像研究，同时其靶向生物作用模式（包括细胞毒性、光毒性，以及在光动力治疗中的应用潜力）也成为研究热点。铱(III)配合物的优势还包括配体可逐步修饰以调控溶解度、电荷等关键物理性质，以及本征光物理属性，可实现发光波长红移至深红光区。这些设计特性结合动力学惰性（kinetic inertness）与高光稳定性，使功能性有机金属铱(III)配合物在生命科学领域具备实际应用价值。过去10–15年中，大量研究凸显了八面体环金属化铱(III)物种可通过荧光显微镜（及其时间分辨、寿命成像变体FLIM/PLIM）适配生物研究的优势。这些属性对理解铱(III)配合物与DNA等常见生物分子的相互作用机制尤为重要，尤其当细胞内靶点为含DNA的细胞核或线粒体时，以及考虑铱(III)物种的光毒性时。值得注意的是，即使无手性配体，八面体铱(III)配合物仍存在Δ与Λ光学异构体，不同对映体与DNA的相互作用可能存在差异。理解此类配合物与DNA的结合机制是设计下一代治疗与诊断试剂的核心，本综述将围绕铱(III)配合物作为DNA结合剂的设计原则、用于探究此类体系的生物物理技术，以及通过非共价接触（如沟槽结合与嵌入）和共价键路径实现的多样DNA相互作用展开论述。

3 研究DNA结合的生物物理技术

针对铱(III)配合物等化合物的DNA结合研究，核心问题包括“结合位点在哪里”与“结合强度如何”：前者聚焦结构信息，即产生结合的结构类型与相互作用；后者聚焦亲和力数据，即相互作用的强度，反映结合所需的物质浓度。二者互为补充：结合剂与DNA的分子结构决定相互作用模式，进而决定相互作用性质，而结合剂与DNA的相互作用（结合脱溶剂化与结构变化效应）最终决定化合物对DNA的亲和力。下文将介绍一套相对易实现的实验流程，可同时获得亲和力与结构数据，以铱(III)配合物与双链DNA的相互作用为背景展开，类似方法也可拓展至其他DNA结合剂与其他靶点（如铱(III)配合物靶向四链体DNA结构）。

3.1 通过对接研究探索DNA结合

化合物与DNA的四种结合模式包括：1）嵌入；2）次沟槽结合；3）主沟槽结合；4）外部静电相互作用（嵌入与次沟槽结合为典型模式）。分子对接研究可在合成实际化合物前，初步判断化合物与DNA结合的可行性及潜在结合模式，可及性极高。现有多种对接工具包可用，Intercalate为专用工具，而AutoDock与AutoDock Vina因易用性与开源特性成为主流选择。需注意AutoDock Vina的优化目标为小分子与蛋白质的相互作用，未针对DNA参数化，且仅覆盖元素周期表的部分元素；同时Vina不显式考虑静电相互作用，且所有对接软件通常默认对接靶点为刚性结构（虽可定义部分柔性基团）。尽管存在上述局限，只要预先构建含嵌入间隙的DNA结构，Vina对DNA结构的对接表现仍可满足需求：研究者可基于嵌入位点的DNA结构参数分析制备此类结构，或通过对接研究结合分子动力学模拟生成含嵌入间隙的DNA结构，也可移除已有带嵌入剂的DNA结构中的嵌入剂后使用。DNA结合剂的结构可优先从晶体结构获取，若无则常规结构最小化即可满足需求，微小键长差异通常不会显著影响对接结果。对接结果解读需谨慎：预置嵌入位点的靶结构会引入能量偏向，使嵌入模式的能量成本未被纳入计算；同时计算的结合能受对接算法近似影响，但评估最优结合模式仍能很好指示可行结合模式及其能量相近程度。典型对接仅涉及单个结合剂与单个靶分子，无法有效模拟外部堆叠效应。针对铱配合物的对接，需注意铱未被参数化，可采用临时替换策略：在不改变原子坐标的前提下，将结合剂结构中的铱离子替换为钴离子，完成对接后再将钴替换回铱。该方法适用于铱离子完全被配体包围（即铱与DNA无直接相互作用）且配位环境无明显柔性的配合物；若铱离子直接与DNA相互作用，则不推荐使用此替换方案。除评估不同DNA结合模式的可行性外，对接研究还可直接提供预期结合位点大小的信息：可视化对接结构可立即显示目标铱配合物可能涉及的碱基对数目，该值可作为合理预期结合位点大小，与实验数据拟合得到的结合位点大小进行对比。

3.2 获取亲和力数据的生物物理技术

亲和力数据与结构数据互为补充，可通过多种技术获取，本文将其分为光谱技术、获取热力学数据的光谱技术与其他技术三类，重点关注成本相对可控的技术。在讨论生物物理技术前，必须评估DNA结合剂的水溶性。热力学结合模型描述的是溶液中的平衡，由于与DNA的相互作用最相关的场景为水溶液，实验默认在主要为水的溶液中进行，因此必须在测定亲和力前评估铱(III)配合物的水溶性。可通过测定铱配合物的消光系数，再记录过滤或离心后的饱和铱配合物水溶液的紫外-可见（UV–vis）光谱来确定溶解度极限。消光系数的测定过程也可作为早期质量控制手段，因为溶解性不足、聚集与水反应性均可能影响朗伯-比尔（Lambert-Beer）曲线的线性。消光系数还可用于滴定实验中浓度的确定，仅需通过UV–vis光谱与游离结合剂的消光系数即可计算浓度，这意味着仅在测定消光系数时需要准确称量样品，后续生物物理实验所需样品量无需达到可准确称量的量级。对于水溶性差的铱配合物，可向缓冲液中加入非挥发性助溶剂（如二甲基亚砜，DMSO），但需注意有机金属铱(III)茂金属衍生物（如[(η⁵-Cp*)Ir(N^N)(L)]^0/n+，其中N^N为双齿配体，L为单齿配体）中L可能对配位溶剂不稳定。此外，高比例有机助溶剂可能导致DNA双螺旋不稳定，需严格控制DMSO的添加量。

3.3 光谱技术

3.3.1 紫外-可见与发光滴定

光谱技术是成本效益最高的研究小分子与配合物和DNA相互作用的方法之一，前提是配合物含有发色团——而典型的铱配合物结构通常包含共轭芳香配体，且多数铱配合物具有发光性，进一步拓展了光谱应用空间。研究铱配合物与DNA相互作用的核心技术包括UV–vis滴定、发光滴定与诱导圆二色（induced circular dichroism, ICD）滴定。这些直接滴定利用配合物结合DNA时光谱性质的变化实现检测；若铱配合物的光谱无法直接观测结合事件，也可采用间接光谱技术，如通过已知嵌入剂溴化乙锭（ethidium bromide, EB）被目标结合剂置换的置换滴定。直接滴定（UV–vis、发光或ICD）均采用相似流程：首先将铱配合物溶于缓冲液，置于比色皿中记录无DNA时的光谱；随后分步加入DNA储备液，每次加入后记录光谱，直至结合剂的光谱不再变化（通常忽略200–300 nm的DNA吸收区域）。数据分析需覆盖宽范围的DNA浓度，理想情况下至少跨越结合位点浓度为0.1×K_d至10×K_d（K_d为解离常数）。首次滴定时K_d未知，因此浓度范围通常通过迭代方式确定。需注意加入的DNA储备液不含结合剂会导致结合剂稀释，可通过三种方式处理：一是使用高浓度DNA储备液，使加入体积可忽略，结合剂浓度基本不变；二是接受结合剂浓度下降，在数据分析中纳入浓度变化；三是向DNA储备液中加入与样品浓度相同的铱配合物，使加入DNA时不稀释结合剂。叠加所有光谱可直观展示DNA浓度升高对铱配合物光谱性质的影响：UV–vis光谱通常反映结合DNA时铱配合物的构象变化与环境变化；发光光谱常表现为发射强度的增色或减色效应，取决于结合DNA是减少激发态猝灭还是提供新的猝灭路径（如铱配合物激发态氧化DNA导致的发射猝灭）；ICD光谱则反映非手性配合物处于手性DNA环境时的信号变化，若未拆分八面体铱(III)配合物的Δ/Λ对映体，DNA滴定的CD光谱解读会较为复杂。光谱滴定的数据分析需谨慎评估数据表示与拟合流程：传统采用Scatchard作图法，定义r为[结合剂]_bound/[DNA碱基对]_total，C_f为游离结合剂浓度，以r/C_f对r作图。但Scatchard作图需线性化实验数据，会引入异方差性（heteroscedasticity），且线性仅在所有结合位点结合常数恒定时成立。现代数据分析更推荐避免数据线性化，直接对原始数据进行非线性模型拟合，McGhee-Von Hippel（MVH）模型是常用选择，其描述了结合剂与均一晶格（如DNA）的结合，核心特点是纳入邻位排斥（neighbour-exclusion）效应，解释“数值可用结合位点”可能因碱基对不连续而无法实际结合的问题。MVH模型还可拓展纳入协同或反协同结合，但常因协同参数定量准确性不足受限；若使用非均一DNA（如鱼精DNA或小牛胸腺DNA），Scatchard图的曲率更可能来自结合剂对不同序列亲和力的自然差异，而非协同效应。相比之下，Crothers提出的多独立结合位点模型（将DNA视为结合位点的序列）因避免过度解读数据细节仍广泛应用。现代曲线拟合软件支持全局拟合，可同时分析多个波长、多个配合物浓度甚至不同光谱技术的数据集，得到统一的K_a（结合常数）与n（结合位点大小）参数，提升参数定量可靠性。拟合完成后需校验参数：评估误差范围与潜在的参数协方差，确保所用模型不过度拟合；拟合的化学计量比应与分子对接的预期结合位点大小合理匹配（如嵌入剂典型结合位点大小为3个碱基对，因嵌入两个碱基对的同时会影响相邻碱基步）。若结合位点显著大于预期，可能提示对特定序列或结构的偏好；若远小于预期，则可能提示存在多种结合位点（如高亲和力位点与低亲和力外部静电堆叠位点共存）。滴定中若出现溶液浑浊、UV–vis光谱中配合物最大吸收波长处吸光度骤降且在非吸收区域吸光度小幅上升，可能提示DNA-结合剂复合物沉淀，需警惕两种结合模式共存的场景。除直接滴定外，间接置换滴定（如EB置换滴定）也可用于提供结构信息。此外，发光光谱滴定可拓展至发光寿命测量：时间分辨发射测量可量化铱(III)配合物结合DNA后激发态寿命的延长，也可利用时间分辨发射光谱区分铱配合物的长寿命发光与背景荧光。

3.3.2 等温滴定量热法

等温滴定量热法（isothermal titration calorimetry, ITC）是不依赖光谱的最通用技术之一，可直接测量铱配合物与DNA相互作用伴随的内禀热效应，是溶液分子相互作用研究的金标准，不仅能直接获取热力学参数，且极难在无真实相互作用时产生假阳性数据，设备普及度高且滴定全程自动化。典型ITC实验中，铱配合物与DNA需溶解于匹配缓冲液中（缓冲液不匹配会引入混合热效应干扰），DNA溶液置于样品池，铱配合物溶液置于自动滴定注射器，逐步注入DNA溶液中，记录样品池的热流随时间的变化。积分每次注射的热流峰，并将每摩尔注射铱配合物对应的积分热除以注射摩尔数，得到摩尔热效应，再对摩尔比作图。理想滴定曲线呈S型，其形状由c值（c = K_a× 样品池中结合位点浓度）决定：c值>5时，S型曲线可直接定量热力学结合参数；c值较低时仅在特定严格条件下可获得可接受的热力学参数定量。ITC实验还要求浓度设置能产生可测量的热信号，通常样品池中结合位点浓度为5–500 μM，注射器中铱配合物浓度需约为样品池结合位点浓度的10倍，以使滴定中点（1:1结合位点:铱配合物）位于滴定中部。滴定也可反向进行（将DNA滴入铱配合物溶液），但常规正向滴定的优势在于初始阶段优先结合强亲和力位点，弱亲和力位点的结合出现在滴定后期，这与光谱滴定中初始结合剂过量、所有位点先被占据、后续结合剂从弱位点迁移至强位点的过程形成互补。ITC的另一优势是可敏锐识别相互作用物种的聚集现象，这对光谱滴定常被忽略的问题尤为重要（如某些水溶性阳离子铱配合物的聚集对反离子浓度敏感）。ITC对一切伴随热效应的相互作用均敏感，因此数据分析需描述所有被测相互作用，多参数模型的参数协方差风险较高，需尽可能简化平衡系统与热效应：包括使用匹配缓冲液消除缓冲液混合热、避免结合剂聚集（如通过调整缓冲条件抑制铱配合物聚集）。理想情况下，简化的S型数据可直接用仪器厂商的标准软件分析；复杂数据则需自定义分析模型，如Lincoln团队开发的模型适用于均一DNA序列结合且结合剂之间存在相互作用的场景，若存在多种结合位点或结合剂发生溶液聚集，可使用I2CITC软件分析。ITC区分不同结合位点的能力通常优于光谱滴定，例如可明确证明铱配合物与DNA存在两种结合模式，并分别得到两种模式的平衡常数与结合位点大小。进一步的热力学参数可通过经验关联（ΔH与DNA结合模式的关联）解读，ITC实验还可通过不同温度下的实验测定热容变化，进而估算可及表面的埋藏程度。

3.3.3 获取热力学数据的光谱技术与其他探索结合的技术

除监测DNA结合对铱配合物光谱性质的影响外，还可通过光谱技术研究加入铱配合物对DNA双螺旋或G-四链体折叠稳定性的影响。典型方法是记录DNA溶液升温过程中的UV–vis或圆二色光谱，通过熔点（T_m）判断双螺旋解离为单链或四链体 unfolding的温度。若标准光谱法不适用，可采用F?rster共振能量转移（FRET）熔解实验：对形成双螺旋的每条链（或四链体形成序列的适当位点）进行荧光基团修饰，使两个荧光基团构成FRET对，双链形成或四链体折叠时荧光基团靠近产生FRET信号，高于T_m时荧光基团分离，FRET效率下降。通过分析熔解曲线并结合范特霍夫（Van‘t Hoff）方程，可定量DNA双链形成的热力学参数。这些熔解曲线依赖于DNA浓度、盐浓度与加入的DNA结合剂，在相同条件下比较有无结合剂的熔解曲线，若结合剂稳定双链，则表现为熔点升高（ΔT_m>0），提示其与双链DNA结合。除上述技术外，新型生物物理技术正在商业化，预计switchSENSE与光栅耦合干涉技术（grating-coupled interferometry）也将很快被用于研究铱(III)配合物（及相关物种）对DNA的亲和力。

3.4 DNA结合的结构信息

要明确化合物与DNA的相互作用模式，可采用核磁共振（NMR）光谱与X射线晶体衍射等专业技术获取原子分辨率的结构模型，这类技术通常需要与领域专家合作，不在本综述重点范围内。线性二色性（linear dichroism, LD）光谱也可提供DNA结合模式的结构信息：长链DNA通过剪切力对齐后，LD对发色团跃迁偶极矩相对于对齐的DNA螺旋轴的取向敏感。通常嵌入会使配体吸收带产生负LD信号（跃迁偶极矩垂直于DNA螺旋轴），而沟槽结合产生正LD信号（配体沿与螺旋轴大致平行的沟槽取向）。目前尚未见LD用于研究铱(III)配合物的报道，但已有阳离子钌配合物的相关研究。更易获取的结构洞察技术包括圆二色光谱、粘度测定与分子对接：诱导圆二色光谱不仅可用于滴定定量亲和力，其光谱本身也可定性解读结合模式，如较大的ICD信号提示沟槽结合，二聚体沟槽结合常出现双信号特征，嵌入剂的ICD信号符号取决于跃迁偶极矩相对于伪二重轴（与DNA螺旋轴相似但不完全相同）的取向。粘度测定是成本极低的研究DNA结合模式的方法：嵌入要求形成嵌入间隙，使相邻碱基对间距增大以容纳嵌入剂，导致DNA-结合剂复合物长度增加；而沟槽结合不会显著增加复合物长度。因此嵌入剂结合高聚合度DNA会导致溶液相对粘度（η/η₀）^1/3升高，沟槽结合则无此效应，该方法已被用于多种铱(III)配合物的DNA结合模式研究。竞争实验也可提供结合模式线索：使用已知嵌入剂（如溴化乙锭）与已知沟槽结合剂（如DAPI，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚）制备预结合复合物的DNA，再用目标结合剂滴定，若目标结合剂置换溴化乙锭则可能为嵌入剂，若置换DAPI则可能为次沟槽结合剂。需注意，除原子分辨率结构技术外，单一技术无法给出结合模式的确定性答案，最佳方案是结合多种技术数据与分子对接研究结果，综合获得最准确的结合模式认知。

4 光致发光铱(III)配合物的背景

发光光谱是分析分子探针与DNA相互作用的有力工具，本节简要介绍适用于DNA结合研究的铱(III)配合物的光致发光性质与设计考量。如前所述，半夹心茂金属铱(III)物种通常本征光物理性质较差，因配体场较弱且存在低能级金属中心d态，为非辐射失活提供了高效路径。对此类配合物，可通过引入高度共轭配体促进发射性配体中心三重态（³IL）的布居，或将配体与芳香荧光标记（如BODIPY）共轭，用于活细胞生物成像。铱(III)多吡啶配合物虽在DNA研究中颇具吸引力，但文献报道远少于环金属化同类物，原因是八面体多吡啶铱(III)物种的合成与纯化难度更高，常伴随竞争性邻位金属化副产物（尤其使用未取代联吡啶时）。已有报道显示，使用4,4’-二甲基-2,2’-联吡啶（dmbipy）可制备[Ir(dmbipy)₂(L)]ⁿ⁺型配合物，发射波长约500 nm，寿命为微秒级，易与短寿命荧光物种区分；同型配合物[Ir(phen)₃]³⁺（phen=1,10-菲啰啉）发射波长为455 nm。这类配合物的发射带形常表现出强振动耦合与微秒级寿命，提示为配体中心三重态发射（铱的重原子自旋轨道耦合常数促进了配体上的三重态高效布居），而非通常红移更显著的电荷转移（CT）三重态。最常用的光致发光有机金属铱(III)配合物是包含两个或三个阴离子环金属化配体（C^N）的八面体物种，通式为[Ir(C^N)₂(L)]^n±（L为双齿配体）或[Ir(C^N)₃]。后者通常为电中性，多用于电致发光器件，因除非对配体进行适配修饰，否则在水相中溶解度有限，较少用于DNA研究。整体阳离子配合物则具有明显优势：可优化抗衡离子选择，且能与带负电的DNA产生有利的静电相互作用，因此异质双环金属化配合物[Ir(C^N)₂(L)]⁺更具吸引力（如[Ir(C^N)₂(bipy)]⁺，其中辅助联吡啶为中性）。环金属化铱(III)配合物的合成与纯化技术发展已实现三种配体均不同的异质物种[Ir(C^N)(C^N’)(L)]^n±的可控合成，可精准调控配合物的（光）物理性质。关键的是，环金属化铱(III)配合物中配体的选择与组合决定了其光致发光性质，为调控所需属性提供了空间。该领域研究已开展二十余年，以2-苯基吡啶（ppy）衍生物为代表的C^N配体是基准体系：[Ir(ppy)₂(bipy)]⁺在乙腈中发射波长为602 nm，源于³MLCT/³LLCT态的混合，寿命可达微秒级，量子产率25–40%并不罕见。最高占据分子轨道（HOMO）与最低未占分子轨道（LUMO）的位置可通过配体选择调控：如[Ir(ppy)₂(bipy)]⁺的HOMO涵盖Ir 5d与苯基分子轨道，LUMO主要定域在联吡啶上；而绿色发射的[Ir(ppy)₂(acac)]的HOMO特征相似，但LUMO定域在ppy的吡啶环上，即环金属化配体强烈决定发射性质（来自³MLCT/³LC态）。使用更共轭的环金属化配体（如2-苯基喹喔啉，2-pqx）时，LUMO定域在C^N配体的喹喔啉部分，为实现发射红移至近红外区提供了切入点。这些考量对设计需要调控光物理参数的铱(III) DNA结合剂至关重要。

5 [Ir(bipy)₂(dppz)]³⁺与[Ru(bipy)₂(dppz)]²⁺的DNA结合行为

多阳离子铱(III)多吡啶配合物的相关性在对比基准金属嵌入剂时尤为凸显。钌(II)多吡啶配合物的DNA结合行为已被广泛研究，混合配体物种[Ru(N^N)₂(dppz)]²⁺（N^N为二亚胺，如2,2’-联吡啶或1,10-菲啰啉；dppz为二吡啶并[3,2-a:2’,3’-c]-菲嗪）或许是最著名的金属配合物DNA嵌入剂，可用于选择性检测非沃森-克里克碱基对错配。其双阳离子电荷促进与带负电DNA的静电吸引，dppz配体的扩展平面性与疏水性促进DNA嵌入。大量研究（尤其是Barton团队的工作）描述了这类配合物及其变体作为DNA发光光开关系统的双重功能：一旦结合DNA，发射强度“开启”，主要原因是菲嗪定域的激发态被屏蔽，避免了溶剂猝灭。即使在三十年后，这类配合物与DNA的光开关效应的光物理起源仍在被研究。因此在讨论铱(III)配合物作为DNA结合剂候选物时，对比结构与DNA结合相关的钌(II)与铱(III) dppz配合物具有重要语境意义。铱(III)配合物虽与钌(II)同为低自旋d⁶电子构型、具（拟）八面体几何构型与动力学惰性，有利于生物场景应用，但直到2015年Thomas团队才报道了水溶性配合物[Ir(bipy)₂(dppz)]³⁺（1），其与基准DNA结合剂[Ru(bipy)₂(dppz)]²⁺为等结构。二者的光学与电子性质存在差异：1在水中可发光（λ_em=479 nm），发射带形具振动结构，归因于定域在dppz上的配体内激发态；加入小牛胸腺DNA（ct-DNA）后发射逐渐猝灭（推测通过涉及核苷酸碱基的氧化还原过程），未表现出与[Ru(bipy)₂(dppz)]²⁺相同的“开关式”³MLCT态行为。通过稳态发光滴定与粘度升高测定，1被证实以嵌入模式插入双链DNA，采用McGhee-von Hippel模型得到的亲和力为1.8×10⁶M^?1，与钌(II)类似物相当。配合物2 [Ir(phen)₂(bppz)]²⁺结构相似，但联吡啶替换为1,10-菲啰啉，菲嗪配体（bppz=苯并[a]吡啶并[2,3-c]菲嗪）为环金属化（即阴离子），为双阳离子类似物。2同样以嵌入模式与DNA结合，亲和力相近（2.7×10⁶M^?1），稳态发光滴定表明结合由疏水效应驱动；其宽发射轮廓（λ_em=522 nm）可能提示更强的MLCT组分，加入DNA后同样猝灭发射，未观察到光开关效应。化合物1与2的研究表明，虽然DNA结合行为可比，但铱(III)配合物的光致发光输出与类似钌(II)体系存在显著差异，在设计铱(III) DNA探针时必须予以考虑。

6 其他铱(III)多吡啶配合物的DNA结合行为

Barton团队设计了异质三配体铱(III)配合物3，引入菲啰啉-9,10-二亚胺（phi，该配体在相关铑(III)基金属嵌入剂中已被熟知）研究DNA相互作用。3通过手性色谱拆分为Δ与Λ对映体，并通过CD光谱确认构型，实现对映体依赖的DNA结合精准研究。phi配体促进配合物嵌入DNA，UV–vis滴定显示35%减色效应与10 nm红移；电化学滴定（在DNA修饰电极上）测得高结合亲和力（K_b≈1.1×10⁶M^?1）。循环伏安法显示溶液中phi配体有一可逆单电子还原峰（?0.025 V vs Ag/AgCl），结合DNA后转变为协同双电子过程；电子顺磁共振（EPR）光谱揭示了溶液中phi基自由基与DNA诱导的双自由基物种。Thomas团队设计了两种三阳离子多吡啶铱(III)配合物4与5，引入扩展的四吡啶基（qtpy）配体以增强DNA相互作用。二者以氯化物盐形式存在时水溶性良好，加入双链DNA后均显示强发光猝灭。采用McGhee-von Hippel模型拟合发光滴定数据，得到高结合亲和力（4为3.7×10⁶M^?1，5为1.5×10⁶M^?1），显著高于其等结构钌(II)类似物。CD光谱显示未破坏双链螺旋性，支持沟槽结合的模式归属；分子动力学模拟提示主要为次沟槽结合模式，qtpy配体沿沟槽平行排列；5还存在次要结合模式，涉及菲啰啉配体的面式插入。光切割实验显示4可作为光激活的光核酸酶，诱导浓度依赖性DNA链断裂。Sheldrick团队报道了细胞毒性三氯铱(III)物种（结构6），形式为fac-[IrCl₃(DMSO)(N^N)]（N^N=bipy、phen、dpq、dppz、dppn）。这类化合物缺乏有益的光物理属性（易发生fac/mer光异构化），但生物活性显著。UV–vis光谱与热变性实验表明仅dppz变体显示弱DNA嵌入，其余均无DNA相互作用。相关阴离子配合物（结构7）组成为[IrCl₄(N^N)]^?（N^N=2,2′-双咪唑或2-(2′-吡啶基)苯并咪唑）被提出可与包括人血清白蛋白在内的多种生物大分子发生结合相互作用，也包括ct-DNA；UV–vis DNA滴定与热变性提示其与DNA存在相互作用（亲和力~10⁴M^?1），可能源于沟槽结合，配位配体与DNA碱基对之间的氢键作用可能克服固有静电排斥。

7 与DNA结合的环金属化铱(III)配合物

两种结构相关的有机金属铱(III)配合物8与9均含dppz辅助配体，区别在于苯基三唑环金属化配体的N取代基（分别为苄基或丙基）。二者的UV–vis滴定均显示加入DNA后出现减色效应，提示与DNA螺旋相互作用。两者结合双链DNA后发光均增强，与嵌入结合模式一致，提示发射来自Ir→dppz的³MLCT态，表现出潜在的光开关效应（dppz单元被屏蔽，避免水相猝灭）。采用MVH模型测得的DNA结合亲和力为8：2.38×10⁴M^?1，9：5.37×10⁴M^?1，8亲和力更低的原因可能是C^N配体上更庞大的苄基产生了显著位阻。8与9的光致发光特性进一步被用于A2780细胞的共聚焦荧光研究，共定位实验显示二者均富集于线粒体（而非细胞核），证明了有机金属配合物用于活细胞靶向荧光成像的可行性。Lo团队报道了一系列功能性发光[Ir(ppy)₂(L)]⁺配合物（L为功能化二亚胺配体），作为DNA嵌入剂与亲和素（avidin）探针。[Ir(ppy)₂(dppz)]⁺与[Ir(ppy)₂(dppn)]⁺均以嵌入模式与ct-DNA结合，结合常数分别为~2.0×10⁴M^?1与7.8×10⁴M^?1（基于Bard/Thorp模型），低于[Ru(bipy)₂(dppz)]²⁺。发光光谱滴定显示[Ir(ppy)₂(dppz)]⁺结合DNA后发射显著增强，归因于dppz配体被疏水屏蔽，避免水介导的猝灭；[Ir(ppy)₂(dppn)]⁺的发射可能含显著dppn定域的³IL特征（而非³MLCT），DNA滴定中发射调制更温和。近期研究提示dppn配体在某些铱(III)配合物中易发生光氧化，需在后续生物应用中予以考量。此外，含dppz、生物素功能化的配合物9（注：此处原文编号复用，指生物素修饰变体）可与亲和素选择性结合，但与DNA无强相互作用，推测原因是生物素的位阻阻碍了嵌入。Lo团队的后续工作显示，整合多个环金属化铱(III)发光团的树状阵列与ct-DNA无强相互作用，但通过静电吸引浓缩质粒DNA，经琼脂糖凝胶阻滞实验证实。Thomas团队研究了相关的环金属化铱(III) [Ir(C^N)₂(N^N)]ⁿ⁺体系10–13，含四吡啶基（qtpy）或阳离子甲基化四吡啶基（Me₂qtpy²⁺）辅助配体，是前文4、5的类似物。单阳离子12、13（即未甲基化qtpy）水溶性差，无法进行有意义的DNA测量；三阳离子10、11（含Me₂qtpy²⁺）则溶解度适宜，显示强次沟槽DNA结合（亲和力约3.5×10⁶M^?1）。沟槽结合的特征为吸收增色效应与粘度负偏移，与其钌(II)/铼(I)类似物的嵌入行为不同。UV–vis滴定与粘度实验明确了其结合亲和力与模式。这些研究强调了水溶性对环金属化铱(III)配合物DNA研究的关键作用：芳香配体天然疏水，若无电荷提升，多数环金属化配合物溶解度不足。另一种策略是使用亲水性辅助配体，促进氢键相互作用，克服单阳离子的限制。受Lo团队前期报道的二胺辅助配体有机金属铱(III)物种启发，作者团队开发了一系列单取代2-苯基苯并噻唑环金属化铱(III)配合物，结合乙二胺（en）辅助配体，[Ir(C^N)₂(en)]⁺（14–18，R=H、Me、OMe、Cl、OCF₃），以氯离子为抗衡离子提升水溶性。这些绿光发射配合物（λ_em=529–540 nm，Φ_em最高达12%）结合DNA后发光增强高达98%，推测原因是配合物被屏蔽，避免猝灭（关键激发态定域在2-苯基苯并噻唑配体上）。时间分辨发射测量证实了这一点：如15（R=Me）加入DNA后寿命从0.399 μs延长至0.807 μs，提示三重激发态被屏蔽。生物物理研究（UV–vis滴定与ITC）揭示双重结合模式：一是高亲和力沟槽结合（K_b=10⁷–10⁸M^?1），沟槽偏好（次/主）受取代基位阻影响（与已有体系一致）；二是较弱的静电相互作用（K_app≈10⁵M^?1）。对接模拟（AutoDock Vina）提示为非嵌入结合模式：14、15结合次沟槽，17结合主沟槽。疏水取代基（如18的-OCF₃）可提升DNA亲和力但降低溶解度。研究过程中注意到配合物聚集现象（常在高盐缓冲液中发生，如14在50 mM NaCl中的临界聚集浓度为2.1 μM），可通过使用5 mM NaCl抑制。ITC数据证实沟槽结合为熵驱动（如14的ΔH≈?3.3 kJ mol^?1，?TΔS=?44.5 kJ mol^?1），与脱水效应一致。综上，这类结构相对简单的有机金属配合物即使缺乏扩展平面配体，仍可与DNA发生强相互作用。Wang团队研究了配合物19–21，为单阳离子[Ir(C^N)₂(N^N)]⁺物种，整合了二氯取代dppz配体（平面性促进通过次沟槽插入的强嵌入结合），C^N配体共轭细节略有差异。分子对接与动力学模拟提示DNA结构发生显著扭曲，碱基对间距从3.39 ?增至6.87 ?，伴随螺旋畸变。尽管这类物种表观疏水，光谱表征显示DNA结合亲和力为3.19–4.88×10⁵M^?1。UV–vis滴定显示特征性减色效应（最高27%）与红移，荧光猝灭与粘度测量证实嵌入结合模式。DNA结合亲和力趋势（19>20>21）与C^N配体的位阻特征（ppy < bzq < piq）及配合物的细胞毒性相关。近期研究还显示，阳离子异质三配体苯基-1H-吡唑铱(III)配合物