5′前导区缺陷驱动长期抗逆转录病毒治疗下的持续性HIV-1病毒血症

《Nature Communications》：5′ leader defects drive persistent HIV-1 viremia on long-term ART

　　

尽管长期抑制性抗逆转录病毒治疗(ART)，HIV-1 RNA的痕迹可在血浆中持续存在。一些个体发展出不可抑制性病毒血症(NSV)，其特征是可检测的HIV-1 RNA，引发对病毒学失败、发病机制和传播的担忧。NSV的来源仍不明确，部分原因是表征血浆HIV-1 RNA的工具有限。具有感染性和缺陷性前病毒（包括5′前导区(5′L)缺陷的前病毒）均可导致NSV，但其相对贡献未被量化。研究人员表明，在超过50名参与者中，血浆病毒血症显著由携带5′L缺陷的高度克隆性HIV-1 RNA群体驱动。在个体间，以主要剪接供体位点(MSD)为中心的5′L缺陷优势克隆占据循环HIV-1 RNA的绝大多数。为快速、可扩展地分析，研究人员开发了CLAWS（无测序捕获5′前导区异常），一种数字PCR(dPCR)检测方法，可区分完整与缺陷性5′L RNA。CLAWS重现了基于测序的估计，并在ART启动后早期检测到低丰度缺陷性RNA，揭示缺陷性基因组在长期治疗期间早期出现并成为主导。这些发现确定了5′L缺陷性基因组是NSV的主要驱动因素，并将CLAWS确立为临床和治愈相关环境中监测病毒血症的实用工具。

**论文解读文章**

**研究背景**
尽管有效的抗逆转录病毒疗法(ART)可抑制HIV-1复制，但病毒仍因潜伏的感染性前病毒库而持续存在。该库在长期治疗后仍高度稳定，部分由于前病毒低诱导性和感染细胞的克隆增殖。然而，超过90%的整合前病毒是缺陷性的，过去认为它们无活性，但现已发现它们具有转录和翻译活性，可产生RNA、蛋白质甚至病毒颗粒。缺陷性前病毒虽不能导致病毒反弹，却能干扰PCR定量检测、促进残留炎症和免疫激活，并产生无效的“诱饵”表位。在ART抑制下，超过半数HIV感染者(PWH)血浆中可检测到痕量HIV-1 RNA（残留病毒血症，RV），部分个体出现持续性或间歇性可检测水平（>20拷贝/mL），即不可抑制性病毒血症(NSV)。NSV的原因复杂，且与病毒学失败、传播风险及健康相关生活质量下降相关，但此前研究样本量小，对5′前导区(5′L)缺陷在其中作用的普遍性认识不足。因此，本研究旨在通过大样本队列明确5′L缺陷对NSV的贡献，并开发快速实用的检测工具。

**研究内容与结论**
研究人员分析了32例NSV患者（原队列）和20例独立验证队列的血浆样本，通过单基因组测序(SGS)和自主开发的CLAWS数字PCR技术，发现5′L缺陷性前病毒产生的RNA在长期ART人群的NSV中占主导地位（中位数95%），缺陷集中位于主要剪接供体位点(MSD)。研究还追踪了10例患者从ART启动到抑制的纵向样本，证实5′L缺陷RNA在治疗早期（约30天）即出现，并随治疗时长逐渐富集。在参与TITAN治愈试验的一名个体中，CLAWS准确区分了NSV期（缺陷性为主）与病毒反弹期（完整性为主）的RNA。这些发现确立了5′L缺陷性前病毒是NSV的主要来源，并提供了CLAWS作为便捷监测工具，对临床管理和治愈研究具有重要转化意义。论文发表在《Nature Communications》。

**主要关键技术方法**
本研究采用的关键技术包括：（1）血浆病毒RNA离心沉淀后，使用群II内含子编码逆转录酶(InduroRT)进行cDNA合成，结合极限稀释巢式PCR和Sanger测序，获得5′L-gag和p6-RT区域单基因组序列；（2）开发CLAWS检测法：基于数字PCR(dPCR)平台，设计一条靶向gag起始密码子(ATG)的参考探针和一条靶向MSD完整序列的“脱落”探针，利用锁核酸(LNA)提高特异性，实现单核苷酸水平区分完整与缺陷5′L RNA；（3）对部分个体使用完整前病毒DNA检测(IPDA)比较前病毒库特征。样本来源于约翰霍普金斯大学、多伦多大学、蒙特利尔大学医院中心等多个临床中心的PWH。

**研究结果**

**HIV-1 RNA变异高度克隆**
通过分析32例NSV患者的血浆RNA序列（获得532条5′L-gag和409条p6-RT序列），发现中位100%（5′L-gag）和96%（p6-RT）的序列完全相同，仅来自少数优势变异（中位数3个和2个），表明NSV由克隆增殖的感染细胞释放病毒颗粒驱动，而非持续复制。罕见耐药突变多存在于历史档案中，不影响当前ART。

**5′前导区缺陷RNA是NSV的主要驱动因素**
在31例参与者的5′L-gag独特变异中，90%（28/31）存在5′L缺陷（MSD点突变或缺失），这些缺陷变异的中位丰度达95%（IQR 69–100%）。与之对比，外周血CD4⁺ T细胞前病毒DNA中5′L缺陷仅占1.2%，且血浆中优势克隆的匹配前病毒在循环细胞中罕见，说明这些缺陷性前病毒虽经克隆扩增但仍属稀有，却不成比例地贡献血浆RNA。4例在ART启动后从未达到完全抑制的参与者，其血浆变异多样性更高、5′L缺陷比例更低（14% vs. 97%），提示不同NSV亚型机制可能不同。

**缺失和突变集中在主要剪接供体位点**
在91个独特5′L RNA变异中，26%含缺失，30%含MSD点突变。缺失（大小2–97 nt）和突变的98%以上破坏MSD。常见的T745A、G744A等位点改变显著影响U1 snRNA识别，导致剪接异常和病毒复制能力丧失。G746A在人群中罕见但不影响复制，而G744A和T745A几乎完全消除复制。这些结果表明，虽然缺陷破坏了复制能力，但维持了转录活性，使这些前病毒逃避免疫清除而持续存在。

**单一数字PCR检测可识别5′L缺陷**
基于缺陷高度集中于MSD附近的特征，研究人员设计了CLAWS：一个dPCR双探针体系（ATG参考探针、MSD脱落探针）。用合成DNA模板验证，CLAWS可在单核苷酸分辨率下正确区分完整与缺陷序列。将WT和T745A突变NL4-3病毒按比例混合在健康捐献者血浆中测试，CLAWS准确解析混合比例。灵敏度检测显示95%检出限为9拷贝/mL，与VQA标准样验证结果一致。

**CLAWS与5′L-gag RNA测序高度相关**
在27份来自原始NSV队列的配对样品中，CLAWS估计的完整5′L RNA比例与测序结果强相关（Spearman r=0.84, p<0.0001）。在20例独立验证队列（共产生482条新序列）中，相关性更高（r=0.9, p<0.0001），系统偏差极小（均值差-1.9%）。在TITAN试验参与者ID0139中，由于存在罕见G746A突变导致标准MSD探针失效，但使用定制探针后CLAWS信号恢复正常，与测序相关性达r=0.96。

**CLAWS揭示ART期间5′L缺陷RNA逐渐富集**
对10例患者从ART启动前至第二相病毒衰变期（约30天）的纵向血浆分析显示，5′L缺陷RNA在治疗前罕见（1/10，0.7%），第二相时出现于6/10例，平均缺陷比例升至0.93%（p=0.04）。在全部47例NSV参与者中，长期ART（中位19年）组血浆完整5′L RNA中位数仅5.3%，而短期ART（中位3年）组为91.7%（p=0.006），支持缺陷RNA随时间逐步富集。CLAWS对前病毒DNA的检测也显示，CD4⁺ T细胞中95%的5′L完整，与血浆中8.4%完整形成鲜明对比，进一步证明缺陷前病毒在血浆中的过度代表不是单纯克隆扩增所能解释。

**研究结论与讨论**
本研究证明，在长期ART的PWH中，5′L缺陷性前病毒驱动的RNA是NSV的主要来源。缺陷集中在MSD，破坏剪接并消除复制能力，但转录活性保持，使这些前病毒在免于细胞病变和免疫清除的同时持续产生病毒颗粒。基于此发现开发的CLAWS技术，作为快速、可扩展的dPCR工具，可在临床和治愈研究中替代繁琐的测序用于病毒血症监测，并已在独立队列和治愈试验中得到验证。研究也指出，CLAWS当前检测下限为9拷贝/mL、主要针对B亚型等局限性，未来需在更大纵向队列和非B亚型中验证。总之，这些结果确立了5′L缺陷性前病毒是NSV的主要驱动因素，而CLAWS为解析持续性病毒血症提供了实用手段。