基因组与系统发育基因组分析揭示尼日利亚土壤中分离的鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)具有广泛的多样性

《Scientific Reports》：Genomic and phylogenomic analyses reveal extensive diversity among soil-derived Acinetobacter baumannii isolates from Nigeria

　　

本研究报告了对从尼日利亚联邦首都特区生态差异显著的场地土壤中回收的24株代表性鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)分离株进行的基因组表征。在分析的43份土壤样品中，共回收101株不动杆菌属(Acinetobacter spp.)，其中主要为鲍曼不动杆菌(39/101；38.61%)。对24株鲍曼不动杆菌分离株的分析揭示了广泛的遗传多样性，包括20种不同的巴斯德(Pasteur)序列分型(sequence type, ST)和19种牛津(Oxford) ST，其中分别有15种和13种为新型ST。此外，研究人员检测到20种荚膜(KL)位点和7种脂寡糖外核(outer core lipooligosaccharide, OCL)位点类型。计算机预测(in silico prediction)显示，大多数分离株不携带临床相关的抗菌素耐药(antimicrobial resistance, AMR)基因，且与已知的国际克隆复合体(international clonal complexes, ICs)无关。然而，一株分离株(A23-4)属于国际克隆8(international clone 8, IC8)谱系，并携带一个与1类整合子(class 1 integron)相关的多重耐药(multidrug resistance, MDR)盒，包含ant(3″)-Ia、dfrA1和sul2基因，侧翼为插入序列(insertion sequence, IS)ISAIw4、ISVsa3和IS1006。进一步分析确定了4975个泛基因组(pangenome)基因簇，以及鲍曼不动杆菌分离株在多个不同进化谱系中的多系分布(polyphyletic distribution)。所研究的土壤样品蕴藏着高度多样化且大多对抗菌药物敏感的鲍曼不动杆菌种群，富含新型谱系。然而，MDR ST10/IC8克隆的检测凸显了基因组监测在识别环境储库中潜在高风险菌株方面的价值。

该研究论文发表于《Scientific Reports》。当前鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)作为世界卫生组织指定的关键优先级病原体，临床中碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌(carbapenem-resistant A. baumannii, CRAb)流行严重，但关于其自然生态环境（尤其是非洲尼日利亚土壤环境）中该菌的基因组多样性、耐药组(resistome)与毒力组(virulome)缺乏系统性数据；既往多数研究未能从原始自然环境中成功分离多重耐药鲍曼不动杆菌，且认为其主要局限于医院及人为影响环境，因此对土壤等非临床环境中该菌的生态适应性与公共卫生风险认识不足。研究人员通过开展尼日利亚联邦首都特区土壤来源的鲍曼不动杆菌分离株基因组与系统发育基因组分析，得出这些环境分离株具有极高的遗传多样性和新型序列分型(sequence type, ST)，荚膜(KL)与脂寡糖外核(outer core lipopolysaccharide, OCL)位点类型丰富，绝大多数分离株不携带临床相关抗菌素耐药(antimicrobial resistance, AMR)基因且不属于已知国际克隆复合体(international clonal complexes, ICs)，但检出一株属于国际克隆8(international clone 8, IC8)且携带1类整合子介导的多重耐药(multidrug resistance, MDR)基因盒的ST10分离株A23-4，泛基因组(pangenome)规模达4975个基因簇且系统发育呈多系分布(polyphyletic distribution)；研究表明尼日利亚土壤蕴藏高度多样且大多抗菌药物敏感、富含新型谱系的鲍曼不动杆菌种群，同时也证实环境可作为高风险临床克隆的储库，凸显了在资源有限地区开展一体化健康(One Health)框架下环境基因组监测的重要性。

研究人员主要采用以下关键技术方法：样本队列来源于尼日利亚联邦首都特区两类行政区共43份生态差异显著的土壤样品；分离鉴定采用选择性富集培养与bla_OXA?51?like基因PCR检测及rpoB基因测序判定物种；全基因组测序采用Illumina NextSeq平台双端测序，用Shovill流程（含Trimmomatic、SPAdes）组装，CheckM2与QUAST评估质量；物种确认采用FastANI比对；多位点序列分型(multilocus sequence typing, MLST)采用Pasteur与Oxford方案，核心基因组MLST(core genome MLST, cgMLST)用chewBBACA，最小生成树用MSTree V2；抗菌素耐药基因、插入序列(insertion sequence, IS)、质粒复制子分别用ABRicate比对ResFinder、自定义ISfinder库、ABAplasmids库筛查，耐药基因环境用gggenomes可视化；毒力基因用ABRicate比对VFDB；荚膜(K locus, KL)与脂寡糖外核(outer core locus, OCL)用Kaptive判定；泛基因组(pangenome)用Panaroo计算并分类为核心、软核、壳、云基因；系统发育分析提取核心基因组SNP用IQ-TREE建最大似然树，并与全球IC代表株及尼日利亚公开基因组比对；统计与绘图在R中进行。

Results（结果）

基因组统计与组装质量：研究人员通过对24株鲍曼不动杆菌基因组的组装评估得出，23个基因组完整性为100%，污染极低（最高0.46%），基因组大小3.58–3.85 Mbp，GC含量38.81%–39.14%，N50为33,366–466,744 bp，L50为3–37，注释获得3345–3557个编码序列(coding sequence, CDS)，rRNA为3–8个，tRNA为61–64个，均含1个tmRNA，质量满足下游分析。

MLST分析：基于Pasteur方案，24株菌分属20种ST，其中15种为新型（ST2810–ST2813、ST2815–ST2825），其余为ST10、ST280、ST309、ST806等，大多数ST为单株独有，最小生成树显示菌株间多相差3–5个等位基因错配；Oxford方案检出19种ST，13种为新型，1株因缺一个分型位点未定ST；核心基因组MLST(cgMLST)分析显示种群结构高度多样，多数菌株间等位基因差异超过2396个，仅少数局部成簇（如A27-2与A27-6仅差8个等位基因）；95.8%（23/24）菌株不属于已知12个IC，仅ST10分离株A23-4属于国际克隆8(IC8)。

抗菌素耐药基因、IS元件与质粒分型分布：计算机预测显示每株携带2–5个AMR基因，23株仅含2个（均为固有bla_OXA?51-like变体，共17种变体，最常见bla_OXA?106与bla_OXA?408），仅A23-4有5个AMR基因，额外含ant(3″)-Ia、dfrA1、sul2；bla_OXA?51-like基因侧翼（±5 kb）无IS元件如ISAba1，处于保守染色体环境（上游pitA、sutR）；A23-4的ant(3″)-Ia等MDR基因位于1类整合子结构，上游ISAIw4、下游ISVsa3与IS1006，提示IS介导的水平转移；质粒复制子分型仅8株有质粒，最常见pABLAC1（6株），其次pB8300（2株），3株共载多个质粒。

泛基因组分析：Panaroo计算出共4975个基因簇，其中核心(core)2671个、软核(soft-core)196个、壳(shell)958个、云(cloud)1150个。

外多糖荚膜(KL)、脂寡糖外核(OCL)位点类型与毒力基因：KL分型得20种KL，KL9、KL19、KL24、KL98在多株出现；OCL仅7种，OCL1与OCL4最常见；毒力基因预测发现clpP、htpB、kdsA、manB、pilT在所有24个基因组中保守存在，ureB、tviB在大部分中存在，其余较少见。

系统发育重建与全球背景：最大似然树显示研究菌株分散于多个进化谱系，呈多系分布(polyphyletic distribution)，与MLST一致；A23-4（ST10/IC8）与公开基因组GCA_016511635.1聚于同一亚支，核心基因组仅差64个SNP；部分研究菌株（C3-1、B22-2、A27-2、A27-6等）与先前尼日利亚基因组形成单系亚支。

Discussion（讨论）

研究人员在讨论中指出，本研究首次提供了尼日利亚土壤来源鲍曼不动杆菌的基因组表征数据，显示物种多样性高、序列分型多为新型且AMR基因与荚膜多糖谱丰富；土壤分离率（55.8%）高于欧洲大生态研究（约30%），可能与当地温度、抗生素使用、人与动物环境交互等有关；遗传多样性高，新Pasteur ST反映当地种群独特性，与尼日利亚临床分离株中发现独特Oxford ST的结果一致；检出ST10（IC8）土壤分离株令人担忧，因为IC8含高毒力株如LAC-4，且在尼日利亚医院中已是重要临床威胁（常携bla_OXA?23碳青霉烯酶），表明土壤不仅是被动储库而是具有临床相关性的社区储库；A23-4携带可移动的MDR基因盒（ant(3″)-Ia、dfrA1、sul2于1类整合子，侧翼ISAIw4、ISVsa3、IS1006）可通过水平基因转移向临床菌株扩散，凸显一体化健康(One Health)基因组监测必要性；泛基因组与系统发育显示明显谱系分异，固有bla_OXA变体异质分布反映局部选择压；研究局限包括采样仅限联邦首都特区、未进行表型药敏试验、短读长测序限制移动元件解析、缺乏土壤成分与抗生素污染元数据；尽管局限，研究首次揭示尼日利亚土壤鲍曼不动杆菌基因组特征，未来需用长读长测序、功能验证与表型试验深化。

Conclusion（结论）

研究人员总结认为，尼日利亚土壤蕴藏遗传多样化且大多对抗菌药物敏感的鲍曼不动杆菌分离株；检出高风险克隆（ST10/IC8）并携带获得性AMR基因阵列，凸显了环境监测和在一体化健康(One Health)框架下将AMR监测整合到面临日益增强抗生素压与临床诊断能力有限的地区的重要性。