《Scientific Reports》：Insights into demographic and cultural influences on the oral microbiome from historical Japanese dental calculus
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基因组学技术的最新进展使得利用牙结石对古代微生物组进行详细分析成为可能。尽管大多数研究集中于欧洲和北美人群，但古代日本人口腔微生物组的研究在很大程度上仍处于空白。本研究中，研究人员主要分析了来自江户时代（17-19世纪）个体的牙结石，以探究古代口腔微生物组的组
基因组学技术的最新进展使得利用牙结石对古代微生物组进行详细分析成为可能。尽管大多数研究集中于欧洲和北美人群，但古代日本人口腔微生物组的研究在很大程度上仍处于空白。本研究中，研究人员主要分析了来自江户时代（17-19世纪）个体的牙结石，以探究古代口腔微生物组的组成、功能和系统发育多样性。研究结果显示，古代与现代日本微生物组之间存在明显差异，且绳文时代晚期（约公元前1000年）与江户时代之间存在系统发育分化。研究人员还发现了古代口腔微生物组的区域变异，以及与牙周炎相关的古菌Methanobrevibacter oralis分支水平的多样性。有趣的是，具有铁浆（ohaguro，一种江户时代女性实施的牙齿染黑习俗）痕迹的个体均被归为同一分支，这表明文化因素对口腔微生物组存在影响。这些发现强调了人类文化和人口统计学在塑造微生物组进化动态中的重要作用。
人类身体不同部位形成了独特的细菌群落，包括皮肤、口腔和肠道，这些微生物组在宿主生理中发挥关键作用，并影响人类健康与发展。近年来，研究人员发现可通过粪化石（coprolites）和牙结石重建和分析古代人类微生物组，通过与现代人微生物组比较来研究微生物组多样性的时间变化及其生物学意义。该方法尤其适用于高温高湿环境下古代人类基因组保存不佳的东亚和大洋洲地区，保存良好的牙结石细菌DNA为研究人类种群历史提供了替代手段。
在日本，利用牙结石开展的古代微生物组研究已取得一定进展。已有研究表明，与牙周炎相关的细菌群落经历了历史变化；Methanobrevibacter oralis（一种与牙周炎相关的古菌）在江户时代女性牙结石中的检出频率高于男性，可能与铁浆习俗有关。此外，Anaerolineaceae sp. oral taxon 439的系统发育分析揭示了绳文时代晚期与江户时代谱系的独特性，表明存在时代特异性的系统发育多样性。然而，与西方国家相比，利用日本古代牙结石的研究仍然有限。江户时期的样本具有独特优势：国家锁国政策（sakoku）最小化了外国影响；藩国间旅行受限使得区域变异可被检测；相对较近的年代确保了微生物DNA的更好保存。基于这些背景，研究人员开展了这项研究，旨在深入探究古代日本人口腔微生物组的多样性，并阐明其与现代微生物组的共性与差异。该论文发表在《Scientific Reports》。
研究采用的主要关键技术方法如下：样本队列来自9名现代日本人（新潟县）和118名古代日本人（主要为江户时代，涵盖东京、埼玉、山梨、福冈和冲绳等地），另有公开数据集包括西班牙现代人、意大利古代人、绳文人、尼安德特人及土壤样本。古代与现代牙结石样本分别在专门的古DNA洁净空间和标准分子生物学实验室处理。DNA提取分别采用DNeasy PowerBiofilm试剂盒（现代样本）和基于硅膜的优化降解DNA提取方案（古代样本）。文库构建使用NEBNext Ultra II系列试剂盒，在Illumina MiSeq平台进行鸟枪法测序。质量控制使用fastp进行，人源reads通过KneadData去除，土壤污染使用decOM评估。分类学分析采用DIAMOND比对NCBI nr数据库，通过MEGAN进行最低共同祖先（LCA）算法分类，并基于人类口腔微生物组数据库（HOMD）筛选口腔类群。微生物组组成分析使用Bray-Curtis距离和主坐标分析（PCoA），组间差异采用PERMANOVA和相关统计检验。功能注释基于SEED数据库二级分类。系统发育分析采用两种方法：基于参考基因组的reference-based方法（使用MetaPhlAn和StrainPhlAn提取物种特异性标记基因）和基于组装的assembly-based方法（使用MEGAHIT组装、MaxBin2和MetaBAT分箱、DAS Tool整合获得宏基因组组装基因组MAGs，经CheckM质量评估，PhyloPhlAn分类，SKA提取SNP）。分歧时间估计使用IQ-TREE，以样本年代作为校准点。
**研究结果**
**现代牙结石微生物组的分类学组成**
研究人员对现代日本人和西班牙人牙结石样本进行PCoA分析，发现一个由4名日本人样本组成的小聚类位于较低PC1值区域，可能提示口腔微生物组组成的地理变异有限。进一步分析发现，较高PC1组中Streptococcus sanguinis显著富集，而较低PC1组中Treponema denticola丰度更高。值得注意的是，与牙周病相关的"红复合体"（Red Complex）三个成员——Porphyromonas gingivalis、Tannerella forsythia和T. denticola在两组间均存在显著差异，提示该聚类模式可能反映口腔健康状态而非地理变异。
**古代牙结石样本的污染评估**
研究人员使用decOM评估新测序古代牙结石样本的污染情况，发现部分样本含有大量非口腔微生物reads。在基于物种水平分类学谱的PCoA中，部分古代样本与土壤样本聚类，提示可能存在环境污染。为最小化该影响，研究人员基于HOMD筛选已知口腔类群进行重新分析。验证表明，该方法对现代样本影响极小（PCoA前后高度相关），而对土壤样本可有效去除污染物（仅1.1±1.5% reads保留），证实了该方法的有效性。
**古代与现代日本微生物组的比较**
研究共鉴定出285种口腔物种。在符合过滤条件的样本中，PCoA显示古代与现代样本沿PC1明显分离。虽然PC1与检测物种数相关，但即使控制该因素后，古今差异仍然显著。M. oralis在古代样本中显著富集，这一结果与欧洲研究一致。
**古代日本微生物组的区域与社会差异**
从128个古代样本中鉴定出259种已知口腔物种。PCoA揭示了本州/九州与冲绳之间的区域差异，特别是在限制样本质量后，沿PC2出现轻微区域分离。M. oralis、Actinomyces sp. oral taxon 414和A. dentalis在区域间存在显著丰度差异。关于社会地位影响，在较高等级个体（大名和旗本）与其他阶层比较中，虽然PERMANOVA显示显著差异，但在限制样本质量后该差异不再显著。同样，城市（东京人形町）与农村（山梨盐川）间的差异在严格质量控制后也未能保持统计显著性。
**微生物组的功能分析**
基于SEED二级分类的功能谱PCoA显示，除一个古代样本外，现代与古代微生物组沿PC2形成两个独立聚类，提示可能存在功能谱的时间差异，但PERMANOVA未达统计学显著。
**微生物物种的系统发育时代分离**
为阐明Anaerolineaceae sp. oral taxon 439在绳文与江户时代的系统发育关系，研究人员采用reference-based方法进行分析，结果支持存在绳文特异性分支，与先前研究一致。此外，研究人员还在S. sinensis、Eubacterium minutum和Candidatus Nanosynsacchari sp. TM7_ANC_38.39_G1_1等物种中发现了此前未报道的江户与绳文时代间的系统发育分化。
**M. oralis的系统发育多样性及其与宿主性别的关联**
在所有检测物种中，M. oralis基于reference-based方法获得了最全面的系统发育信息，涵盖49个样本。系统发育分析揭示了两个主要分支，分支归属与宿主性别存在统计学显著关联。在一个父女对中，父亲的M. oralis聚类于男性相关分支，而女儿的属于女性相关分支。尤为重要的是，所有先前报道具有铁浆痕迹的女性样本均被归为同一分支。
采用assembly-based方法进一步分析，M. oralis获得最多满足质量阈值的MAGs（34个）。分析再次呈现两个分支，且与宿主性别相关，与reference-based结果一致。通过末端DNA损伤模式评估排除了现代人类唾液污染的可能性，支持序列的真实性。两个分支被命名为clade A（男性相关）和clade B（女性相关）。
**M. oralis分支的比较基因组学分析**
为进行clade间的比较基因组学分析，研究人员筛选高质量MAGs（完整性≥80%，污染度≤5%），clade A有15个，clade B有16个。鉴定出clade A特异性基因18个，clade B特异性基因7个。其中clade A的7个基因和clade B的2个基因获得功能注释。值得注意的是，clade A的一个特异性基因含有SpoVT/AbrB样结构域，该结构域已知参与抗生素抗性和生物膜形成相关基因的转录调控。
鉴于铁浆习俗在江户时代成年女性中尤为普遍，且涉及铁 rich 物质的应用，研究人员探索了clade特异性铁代谢相关变异。在甲基紫精氢化酶（Mvh）基因家族中，鉴定出mvhA的2个clade特异性替换和mvhB的3个clade特异性替换。与相关分类群参考序列的比较显示，所有clade A变体与M. oralis参考序列一致，而mvhB中的两个替换（173位和372位）为clade B所特有。
利用IQ-TREE估计两个分支的分歧时间，reference-based分析为366 CE（95%置信区间：209–1096 CE），assembly-based分析为289 BCE（CI：831 BCE–469 CE）。结果提示分支分歧可能发生在公元纪年前后数个世纪内。
**讨论**
研究人员对现代牙结石的分析揭示了一个由四个日本样本组成的聚类，该聚类以"红复合体"成员丰度升高为特征，与临床牙周健康状况密切相关。现代日本受试者的平均探诊袋深度为5.2±2.2 mm，表明所有参与者均患有中度至重度牙周炎。这一发现提示，聚类模式可能反映口腔卫生或牙周状况的差异，而非地理变异。更广泛而言，这些结果表明工业化国家现代人群的生活方式西化可能导致口腔微生物组个体间多样性降低，而古代牙结石研究则报道了欧洲和亚洲不同区域间更大的微生物多样性。
与先前基于16S rRNA的研究一致，本研究的鸟枪法宏基因组分析揭示了古代与现代日本口腔微生物组之间的明确组成差异。M. oralis在古代样本中频繁检出，其相对丰度在不同个体间变化显著，而在现代日本样本中未检测到，可能受限于样本量。功能层面，古今样本间亦存在差异，淀粉利用系统（SUS）基因相对丰度显著不同，提示现代人群向淀粉丰富饮食的转变可能影响口腔微生物组结构。
古代个体的分析揭示了本州/九州与冲绳之间的微妙区域差异，可能反映两地区生活方式差异。M. oralis和S. sanguinis被鉴定为区域差异的相关类群，与荷兰古代牙结石研究结果一致，提示这些类群可能是不同地理区域古代口腔微生物组的共同特征。然而，社会地位及城乡间差异在严格质量控制后未能保持显著性。研究结果还表明，改变reads数和物种丰富度阈值会影响PCoA和PERMANOVA结果，凸显环境污染、DNA片段化和脱氨基作用对准确重建古代口腔微生物组的挑战。值得注意的是，主要基于西方人群构建的HOMD数据库可能导致古代日本样本微生物多样性被低估。未来纳入更全面的东亚人群口腔微生物组数据将有助于提高重建准确性。
日本列岛最初由绳文时代的狩猎采集者居住，约公元前10世纪与来自亚洲大陆的农业移民发生混合，开启弥生时代并引入水稻种植。这种混合及随后的文化和人口连续性最终形成了现代日本人群。在时代变异方面，本研究证实了Anaerolineaceae sp. oral taxon 439在绳文与江户时代间的系统发育分化，并在S. sinensis和E. minutum等物种中发现了新的时代特异性分支，提示与弥生时代开始的人口迁移、混合及文化互动相关的系统发育更替，以及从狩猎采集到农业饮食转变对口腔细菌的影响。S. sinensis在古代牙结石中丰富而在现代工业化人群中稀少的发现，表明古代牙结石可能保存了现代人群中正在消逝的口腔细菌进化多样性。
研究人员对M. oralis的系统发育分析一致揭示了两个主要分支，其中一个分支与参考序列发生分化，表明不仅在Methanobrevibacter属内，M. oralis本种内部也存在古老的分化。估计的分歧时间表明分裂发生在公元纪年前后数个世纪，提示该多样化可能在国内出现。值得注意的是，所有来自东京人形町高中的11个样本均属于同一分支，提示分支分布可能存在地理结构。分支归属与宿主性别的统计关联需谨慎解释，鉴于相当比例的个体性别未知。在一个父女对中观察到的分支差异可能反映性别相关的分布模式，与性别特异性适应或传播动态一致。
比较基因组学分析显示，包含参考株的clade A拥有更多分支特异性基因，其中SpoVT/AbrB样结构域的存在提示可能对现代抗生素影响环境下的适应。然而，由于现代日本样本中M. oralis序列检测有限，该多样性是否持续存在于当代人群仍不清楚。先前研究表明M. oralis通过产甲烷过程中的氢消耗与多种口腔细菌发生代谢互作，且与口腔外系统性疾病相关。若能在现代日本人群中更稳定地检测到M. oralis，可能有助于调查此类微生物互作和健康关联是否随时间改变。
所有具有铁浆痕迹的先前报道样本均被归为clade B，提示这一主要流行于江户时代成年女性的习俗与观察到的性别特异性分支分布存在潜在关联。由于铁浆涉及铁 rich 物质的应用，研究人员调查了铁代谢相关基因的clade特异性变异，在mvhA和mvhB中发现了clade B独特的替换。这些变异可能在高铁口腔环境下赋予能量优势，或使原本处于劣势的菌株得以存续。由于本研究未逐样本系统记录铁浆痕迹，未来结合标准化、客观的牙齿染黑评估及残留化合物详细化学分析的研究，将有助于进一步探讨该文化实践与口腔微生物组的关系。
**研究结论**
本研究确认古代与现代日本个体口腔微生物组存在明显差异，以及绳文与江户时代之间存在系统发育分化。研究还发现了古代微生物组组成的区域变异，以及与牙周炎相关物种M. oralis分支水平的多样性。这些发现强调了人类文化和人口统计学在塑造微生物组进化动态中的重要作用。口腔微生物组研究的持续进展将为理解日本微生物进化、文化实践和人类人口历史之间的动态关系提供宝贵洞见。
