《Communications Biology》：Reactivity of mammalian lipoxygenases (ALOX isoforms) with phospholipids, biomembranes and lipoproteins
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摘要：花生四烯酸脂氧合酶（Arachidonic acid lipoxygenases, ALOX 亚型）参与细胞分化及多种疾病的发病机制。人源 ALOX 亚型通常偏好游离多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated Fatty Acids, PUFAs）为
摘要：花生四烯酸脂氧合酶（Arachidonic acid lipoxygenases, ALOX 亚型）参与细胞分化及多种疾病的发病机制。人源 ALOX 亚型通常偏好游离多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated Fatty Acids, PUFAs）为底物，但部分亚型亦可氧化复合酯类脂质。本研究比较了哺乳动物 ALOX 亚型对复合脂质结构的反应活性，探究了氧化产物的化学特征并表征了酶?底物复合物结构。研究人员发现，人源与小鼠 ALOX15 直系同源物以及人源 ALOX15B 能够在无适配蛋白的情况下氧化复合底物，且氧化产物模式与游离脂肪酸氧化相似；相比之下，小鼠 Alox15b 及人源 ALOX12 的相应活性有限。在经基因修饰缺失 ALOX15 基因的小鼠血浆脂质中亦检测到特异性脂氧合酶产物，提示该酶在体内具有对复合酯脂质底物的氧化活性。
研究背景与立题依据
花生四烯酸脂氧合酶（Arachidonic acid lipoxygenases, ALOX 亚型）可催化多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated Fatty Acids, PUFAs）生成氢过氧衍生物，进而代谢为类信号分子，参与炎症、增生、代谢及神经退行性疾病的病理过程。传统观点认为 ALOX 亚型主要氧化经磷脂酶解离的游离 PUFAs，但文献零星报道某些 ALOX 亚型可直接氧化磷脂中的酯化 PUFAs（即膜氧合酶活性），该活性被认为参与网织红细胞线粒体成熟降解及动脉粥样硬化中低密度脂蛋白（Low-Density Lipoprotein, LDL）的氧化修饰。然而，不同哺乳动物 ALOX 亚型对脂质体、天然生物膜（线粒体、内质网膜、红细胞膜）及脂蛋白（LDL、高密度脂蛋白 High-Density Lipoprotein, HDL）等复合底物的氧化能力缺乏系统性横向比较，且 ALOX 催化酯化 PUFAs 氧化是否真正发生于体内亦无直接证据。为此，研究人员系统评估了人源 ALOX15、ALOX15B、ALOX12 及对应小鼠直系同源物 Alox15、Alox15b 对多种复合脂质底物的氧合酶活性、产物立体专一性及酶?底物相互作用，并在基因修饰小鼠模型中验证了 ALOX15 对酯化脂质的体内氧化作用。该论文发表于《Communications Biology》。
主要关键技术方法
研究人员将人源 ALOX15（昆虫 Sf9 细胞表达）、小鼠 Alox15、人源 ALOX15B、小鼠 Alox15b 及人源 ALOX12（大肠杆菌重组表达）的粗酶液按等同花生四烯酸（Arachidonic Acid, AA）氧合酶活性归一化后，分别与下述底物孵育：含亚油酸（Linoleic Acid, LA）为主的人工脂质体（小/大脂质体）、牛心肌线粒体内翻膜（电子传递颗粒 Electron Transfer Particles, ETP）、大鼠肝粗面内质网（endoplasmic reticulum, ER）囊泡、人红细胞血影细胞（ghost）及新鲜分离的人源 LDL 与 HDL。反应终止后提取总脂质，碱水解游离出羟基化 PUFAs 及非氧化 PUFAs，采用反相高效液相色谱（Reversed-Phase High Performance Liquid Chromatography, RP-HPLC）检测并计算 OH-PUFA/PUFA 比值；结合正相/手性相 HPLC（Normal Phase/Chiral Phase HPLC, NP/CP-HPLC）鉴定产物对映体构型（S/R）及共轭二烯保留时间。采用分子对接（Molecular Docking，GOLD 软件）及 100 ns 分子动力学模拟（Molecular Dynamics, MD）分析磷脂分子 1-硬脂酰-2-花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（1-stearoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, SAPC）在兔 ALOX15（PDB 2P0M）及人 ALOX15B（PDB 4NRE）活性位点的结合模式与稳定性。体内实验采用 Alox15?/?小鼠、Alox15 敲入（Knock-In, KI，表达人源 ALOX15 Leu353Phe 突变体）小鼠及携带人源 ALOX15 的 aP2-ALOX15 转基因小鼠，LC-MS/MS 分析血浆酯脂质水解前后特异性氧脂组（oxylipidome）含量变化。
研究结果
功能性哺乳动物 ALOX 亚型表征（Functional characterization of mammalian ALOX isoforms）
研究人员表达并纯化各重组 ALOX 亚型，以 AA 和 LA 为底物验证基础氧合酶活性及产物模式——人 ALOX15 主要产 15S-HETE 与少量 12-HETE，小鼠 Alox15 反之以 12-HETE 为主；人 ALOX15B 专一生成 15S-HETE，小鼠 Alox15b 专一生成 8S-HETE；人 ALOX12 专一生成 12S-HETE。LA 均被氧化为 13S-HODE（小鼠 Alox15b 还产少量 9S-HODE）。证实各重组酶具预期定位与反应专一性，可用于后续复合底物检测。
多数 ALOX 亚型表现脂质体氧合酶活性（Most ALOX isoforms exhibit a liposome oxygenase activity）
归一化 AA 氧合酶活性后，人 ALOX15 脂质体氧合酶活性最高，依次为小鼠 Alox15＞人 ALOX15B＞小鼠 Alox15b；人 ALOX12 未见显著高于对照的活性。较小粒径（0.1 μm）脂质体较大粒径（1 μm）更适为底物。由于完整脂质体无法进入酶底物结合口袋，研究人员推测 ALOX 结合于脂质体表面，"抽提"单个磷脂分子使 PUFA 链伸入活性中心完成区域选择性加氧，氧化磷脂可再整合回双层。
酯化 13S-HODE 是脂质体氧化主要产物（Esterified 13S-HODE was the major oxygenation product formed from liposomes）
因脂质体中 LA 占比最高，各具活性的酶均主要生成酯化 13S-HODE（来源于 LA sn-2 位 C13 加氧），与游离 LA 产物模式一致。值得注意的是小鼠 Alox15b 对脂质体生成 13S-HODE 而非其游离 LA 偏好产物 9S-HODE，提示膜/脂质体环境下底物在活性位点取向改变。无活性酶未检出特异性共轭二烯。
底物分子对接与分子动力学模拟（Substrate docking studies and molecular dynamics simulations）
将 SAPC 对接至兔 ALOX15 及人 ALOX15B 活性中心，优选极性头基朝溶剂、sn-2 花生四烯酰链 C13 靠近非血红素铁、sn-1 饱和酰链埋入疏水口袋的结合构象。MD 模拟显示 SAPC 的 AA 链维持 U 型构象，sn-1 链与疏水残基作用稳定，极性头基经构象翻转后与 Asp174/Gln596（兔 ALOX15）或 Arg429/Gln425（人 ALOX15B）形成氢键/π-阳离子作用，酶?底物复合物在 100 ns 内稳定，从结构上支持完整磷脂分子可被 ALOX15/ALOX15B 活性中心容纳并定向氧化。
ALOX 亚型对线粒体内膜氧合酶活性（Reactivity of ALOX-isoforms with mitochondrial membranes）
人 ALOX15 及小鼠 Alox15 对牛心肌线粒体内翻膜具明显氧合活性（约 15% 膜 PUFAs 被氧化），人 ALOX15B 活性约为前者 20%，小鼠 Alox15b 与人 ALOX12 活性极低且无统计学意义。产物以膜中丰富的 LA 衍生 13S-HODE 为主，AA 衍生 15S-HETE（人/小鼠 ALOX15）或 12S-HETE（小鼠 Alox15）次之；小鼠 Alox15b 对膜底物产 9S- 与 13S-HODE 而非其游离 AA 偏好产物 8S-HETE，再次体现底物物理状态影响产物区位专一性。
ALOX 亚型对内质网膜氧合酶活性（Reactivity of ALOX-isoforms with endoplasmic membranes）
大鼠肝 ER 膜主要含 LA 而几乎无 AA。人 ALOX15 与小鼠 Alox15 ER 膜氧合活性相当且高于其余亚型（人 ALOX15B、小鼠 Alox15b、人 ALOX12 具低但可测活性）。产物以 13S-HODE 为主，人 ALOX15 还检出少量 15S-HETE 及 13S-HOTrE（γ-亚麻酸衍生物），表明酶可从低丰度底物生成对应氧化产物。
对红细胞质膜无反应活性（Lacking reactivity of ALOX-isoforms with erythrocyte plasma membranes）
五种重组 ALOX 亚型均不能氧化人红细胞血影细胞膜酯脂质，提示天然红细胞质膜或因脂质组成、膜蛋白屏障或脂筏结构等因素不被 ALOX 识别。
ALOX 亚型对脂蛋白氧合酶活性（Reactivity of ALOX-isoforms with lipoproteins）
只有人 ALOX15 和 ALOX15B 能显著氧化新鲜制备的人源 LDL 与 HDL（OH-PUFA/PUFA 比值分别约 1.8% 与 0.6%），主要产物为酯化 13S-HODE；小鼠 Alox15、Alox15b 及人 ALOX12 无显著脂蛋白氧合活性。热图汇总显示人 ALOX15＞小鼠 Alox15＞人 ALOX15B＞小鼠 Alox15b≈人 ALOX12；底物偏好为小脂质体＞线粒体/ER 膜＞脂蛋白。
基因修饰小鼠血浆中存在 ALOX15 衍生的氧化酯脂质（In vivo activity of ALOX15 in genetically modified mice）
Alox15?/?小鼠血浆水解酯脂质中 Alox15 特征产物（12-HETE、12-HEPE、13-HODE、14-HDHA）显著低于野生型，非 Alox15 产物（11-HDHA）无差异。Alox15-KI（人源 ALOX15 突变体敲入）小鼠血浆 15-HETE、15-HETrE、17-HDHA 高于野生型，对照代谢物（5-HETE 等）无差异。aP2-ALOX15 转基因（额外表达人 ALOX15）小鼠血浆 17-HDHA、15-HEPE、15-HETE、15-HETrE 高于野生型对照，对照代谢物无差异。证明 ALOX15 可在体内参与酯化 PUFAs 的氧化，其产物可经细胞?血浆脂质交换出现在血浆酯脂质中。
讨论与结论总结
经典类花生酸级联反应认为 ALOX 只氧化经磷脂酶释放的游离 PUFAs，但本研究系统证实人 ALOX15、小鼠 Alox15 及人 ALOX15B 可直接氧化磷脂中酯化 PUFAs——包括人工脂质体、线粒体膜、内质网膜及天然脂蛋白（LDL/HDL），产物区位与立体专一性与游离 PUFA 氧化基本一致（小鼠 Alox15b 产物模式受膜环境影响发生偏移），且红细胞膜不为此类酶的底物。分子对接与 MD 模拟表明完整磷脂分子可被 ALOX15/ALOX15B 活性口袋容纳，sn-2 PUFA 链 C13（LA）或 C15（AA）定向靠近非血红素铁完成加氧。基因修饰小鼠血浆氧脂组学证实 ALOX15 介导的酯脂质氧化发生于活体。研究表明 ALOX15 及 ALOX15B 的双底物（游离/酯化 PUFA）催化能力拓展了对脂氧合酶生物学功能的理解——除参与网织红细胞线粒体清除与动脉粥样硬化脂蛋白氧化修饰外，膜直接氧合可能在不触发磷脂酶活化情况下局部产生氧化磷脂信号，为炎症、代谢病及肿瘤等相关 ALOX 通路研究提供生化依据。
