透明质酸包被负载姜黄素沸石咪唑酯骨架材料-8（curcumin-loaded zeolitic imidazolate framework-8, ZIF-8）与未包被负载姜黄素ZIF-8纳米复合材料体外抗肿瘤功效的比较研究

《Scientific Reports》：In vitro antitumor efficacy of hyaluronic acid coating for curcumin-loaded zeolitic imidazole frameworks-8 (ZIF-8) versus that of uncoated curcumin-loaded ZIF-8 nanocomposites

　　

癌症仍是全球重大健康负担，肝癌存在早期难检出、疗效有限及耐药等问题。沸石咪唑酯骨架材料-8（zeolitic imidazolate framework-8, ZIF-8）作为金属有机框架（metal–organic frameworks, MOFs）的一员，具备结构可调、高孔隙率及孔径可控等优势，是肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）与乳腺癌药物递送的良好载体。本研究将姜黄素（curcumin）载入ZIF-8，并通过逐步、摩尔比及pH依赖的方式在其表面包被透明质酸（hyaluronic acid, HA）。所得负载姜黄素的ZIF-8（CZIF-8）与透明质酸包被负载姜黄素的ZIF-8（CZIF-8/HA）纳米复合材料经ζ电位、扫描电镜（scanning electron microscope, SEM）、透射电镜（transmission electron microscope, TEM）及粉末X射线衍射（powder X-ray diffraction, PXRD）表征，呈不规则半球形，平均粒径分别为127.93 nm和131.07 nm。研究人员采用MTT法评估其对两种癌细胞系（HepG-2与MDA-MB-231）及正常细胞系（MRC-5）的体外抗肿瘤活性，并以阿霉素（doxorubicin）为参照药。此外，研究人员发现纳米复合材料主要通过凋亡（caspase-3表达升高）而非坏死途径诱导肿瘤细胞死亡，并使细胞周期阻滞于G1/S期。两种粒子均具较低半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration, IC50），尤其对HepG-2细胞。进一步研究表明，相较于CZIF-8与阿霉素，CZIF-8/HA对癌细胞（HepG-2与MDA-MB-231）细胞毒性显著更高，而对正常MRC-5细胞毒性极低。结果表明ZIF-8/HA是极具潜力的姜黄素递送纳米载体，可作为肝癌与乳腺癌治疗新策略。

论文解读：透明质酸包被负载姜黄素ZIF-8纳米复合材料用于肝癌与乳腺癌体外抗肿瘤研究

该研究发表于《Scientific Reports》。癌症尤其是肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）与乳腺癌因早期诊断困难、化疗药物毒副作用大及肿瘤靶向性差而亟待新型药物递送系统（drug delivery systems, DDSs）。天然多酚类化合物姜黄素（curcumin）具广谱抗癌活性，但其水溶性差、生理pH下不稳定、体内代谢快且缺乏肿瘤靶向性限制了直接应用。沸石咪唑酯骨架材料-8（zeolitic imidazolate framework-8, ZIF-8）由生物相容性Zn²⁺与2-甲基咪唑配位形成，具高比表面积、孔径可调及在肿瘤微环境弱酸性条件下降解释药的特性，适合作为姜黄素载体；然而裸ZIF-8表面疏水易聚集、血液循环中稳定性不足且无主动靶向能力。透明质酸（hyaluronic acid, HA）是天然亲水性多糖，可特异性结合过表达CD44受体的肿瘤细胞，并能提升纳米粒胶体稳定性与生物相容性。为此，研究人员构建了HA包被的负载姜黄素ZIF-8纳米复合材料（CZIF-8/HA），并与未包被CZIF-8比较其理化性质、体外细胞毒选择性、凋亡诱导及细胞周期影响，以明确HA修饰对ZIF-8基姜黄素递送系统的增效作用。

研究人员采用的主要关键技术方法如下：以pH依赖原位一步法制备负载姜黄素ZIF-8（CZIF-8），再通过静电相互作用将CZIF-8与透明质酸钠孵育获得HA包被样品（CZIF-8/HA）；采用ζ电位仪、TEM、SEM及粉末X射线衍射（PXRD）表征粒径、形貌与晶体结构；紫外-可见分光光度法测定载药量（drug loading capacity, DLC%）与包封率（encapsulation efficiency, EE%）；以人肝癌HepG-2、人乳腺癌MDA-MB-231及正常人肺成纤维MRC-5细胞为实验细胞系（ATCC来源），通过MTT法检测24 h后细胞存活率并计算IC₅₀及治疗指数（therapeutic index, TI＝CC_{50正常细胞}/IC_50癌细胞）；采用流式细胞术进行碘化丙啶（propidium iodide, PI）染色细胞周期分析及Annexin V-FITC/DAPI双染凋亡检测；酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）定量凋亡执行蛋白caspase-3表达水平。

Characterization of CZIF-8 and CZIF-8/HA nanocomposites

ζ电位由CZIF-8的－8.79 mV变为CZIF-8/HA的－28.0 mV，表明HA成功包被并增强胶体稳定性。TEM显示CZIF-8呈较光滑不规则半球形，平均粒径127.93 nm（范围96.10–213.9 nm）；CZIF-8/HA表面略粗糙、聚集更明显，平均粒径131.07 nm（范围64.89–200.0 nm），证明HA涂层存在。SEM显示CZIF-8具多孔粗糙表面，CZIF-8/HA表面致密融合、孔隙减少，符合HA填充或覆盖ZIF-8孔口。PXRD显示两者均保留ZIF-8特征衍射峰位，CZIF-8/HA峰强降低、略有宽化，说明HA修饰引起表面部分非晶化但未破坏ZIF-8骨架。CZIF-8的DLC为4.36%、EE为57.25%；CZIF-8/HA因HA额外质量及部分孔道遮挡DLC降至3.32%、EE降至44.37%。

In vitro evaluation of anticancer activity of CZIF-8 and CZIF-8/HA using MTT assay and their therapeutic indices

MTT结果显示两纳米复合材料对HepG-2与MDA-MB-231呈浓度依赖性细胞毒，CZIF-8/HA在低浓度（7.8 μg/mL）下即显著降低癌细胞活力（HepG-2降至38.56%，MDA-MB-231降至52.61%），强于CZIF-8。IC₅₀值：HepG-2细胞中CZIF-8/HA为5.63±0.47 μg/mL、CZIF-8为32.22±2.13 μg/mL、阿霉素为7.98±0.05 μg/mL；MDA-MB-231细胞中CZIF-8/HA为9.15±2.97 μg/mL、CZIF-8为45.75±0.61 μg/mL、阿霉素为4.68±0.12 μg/mL。正常MRC-5细胞IC₅₀较高（CZIF-8为62.53±6.21 μg/mL，CZIF-8/HA为20.77±1.87 μg/mL），阿霉素在正常细胞中IC₅₀为38.06±1.87 μg/mL。治疗指数（TI）：CZIF-8对HepG-2和MDA-MB-231分别为2.1和1.4；CZIF-8/HA分别为3.71和2.27；阿霉素分别为4.8和8.1。表明HA包被提升了纳米复合材料对肿瘤细胞的杀伤选择性。

Cell cycle arrest promoted by CZIF-8 and CZIF-8/HA nanocomposites

流式细胞术分析显示，HepG-2经CZIF-8处理后G1期细胞增至57.13%（对照S期35.13%），提示G1期阻滞；CZIF-8/HA也使G1期升至51.61%、S期降至28.64%，呈G1/S期阻滞趋势。MDA-MB-231经CZIF-8处理G1期降至49.16%伴S期略降，CZIF-8/HA则使G1期升至59.01%、S期降至31.18%，表明CZIF-8/HA更明显诱导MDA-MB-231细胞G1期阻滞。结论：两种纳米复合材料干扰肿瘤细胞周期进程，CZIF-8/HA更倾向于使两株肿瘤细胞阻滞于G1/S检查点。

Apoptotic effects of CZIF-8 and CZIF-8/HA

Annexin V-FITC/DAPI双染结果：HepG-2中CZIF-8诱导总凋亡19.0%（早凋11.82%＋晚凋7.1%），坏死2.91%；CZIF-8/HA诱导总凋亡23.9%（早凋15.51%＋晚凋8.39%），坏死2.63%。MDA-MB-231中CZIF-8诱导总凋亡23.48%，CZIF-8/HA诱导总凋亡达39.36%（早凋22.35%＋晚凋17.01%）。未处理组凋亡率极低。说明两种纳米复合材料主要通过凋亡而非坏死途径杀伤肿瘤细胞，且CZIF-8/HA凋亡诱导能力更强，尤其在MDA-MB-231细胞中。

Effect of CZIF-8 and CZIF-8/HA on the expression of the apoptosis-regulated caspase-3 protein

ELISA检测显示HepG-2细胞caspase-3基线3.49 ng/mL，CZIF-8处理后为10.18 ng/mL，CZIF-8/HA处理后6.4 ng/mL；MDA-MB-231细胞基线1.54 ng/mL，CZIF-8处理后2.27 ng/mL，CZIF-8/HA处理后2.35 ng/mL。表明两制剂均上调凋亡效应caspase-3蛋白表达，证实死亡方式为线粒体或死亡受体通路介导的凋亡。HepG-2对curcumin介导凋亡更敏感致caspase-3升幅更大。

讨论与结论总结

研究人员讨论指出，HA包被使ZIF-8表面负电荷增加从而提升水相分散稳定性；载药量略降源于HA占据孔道及额外质量加权，但不影响curcumin在ZIF-8内的原位包封保护。CZIF-8/HA对HepG-2的IC₅₀甚至低于阿霉素，且对正常细胞毒性更低，归因于HA与过表达CD44受体的肿瘤细胞亲和促进受体介导内吞及酸性溶酶体中ZIF-8降解释放curcumin。治疗指数提高验证HA修饰增强肿瘤选择性。细胞周期与凋亡检测共同证实死亡机制为G1/S期阻滞伴随caspase-3依赖凋亡途径而非坏死。

原文结论翻译：综上所述，研究人员以摩尔比及pH依赖途径将curcumin载入ZIF-8并经HA包被制备CZIF-8与CZIF-8/HA纳米复合材料。两者呈不规则半球形，平均粒径分别约127.93 nm与131.07 nm，经表征确认HA成功修饰且ZIF-8晶型得以保持。体外实验表明负载curcumin的ZIF-8/HA相较于未包被CZIF-8及参比药阿霉素，对HepG-2与MDA-MB-231癌细胞具更强细胞毒性，而对正常MRC-5细胞影响甚微。CZIF-8与CZIF-8/HA均可上调caspase-3诱导凋亡并使肿瘤细胞周期阻滞于G1/G1S期，其中CZIF-8/HA在MDA-MB-231中G1期阻滞更显著。该ZIF-8/HA纳米体系是curcumin用于肝癌与乳腺癌治疗的 promising靶向递送平台，后续需开展体内实验以进一步验证其疗效与安全性。