四聚体中和与正交催化发夹结构组装技术用于直接差异检测微小RNA

《Analytica Chimica Acta》：Tetrameric Neutralization and Orthogonal Catalytic Hairpin Assembly for Direct Differential Detection of MicroRNA

　　

吴学强|蒲旭阳|熊娜婷|张银梅|徐泰

中国梅州市梅州市人民医院基础医学科学研究所，514031

摘要

背景

微小RNA（microRNAs，miRNAs）是乳腺癌的宝贵无创生物标志物，然而在连续监测中的临床应用受到传统检测方法对绝对定量和复杂标准化需求的限制。一个能够直接比较两个样本中miRNA丰度的平台将简化这一过程并减少累积的分析误差。

结果

我们提出了一种概念验证检测方法，该方法通过四聚体中和机制直接比较miRNA水平。两种发夹探针CNP1和CNP2捕获目标miRNA形成二聚体复合物。当它们结合时，等摩尔的二聚体会组装成惰性的mCCm四聚体，而来自miRNA浓度较高样本的多余二聚体会与正交的SROMB探针发生催化性发夹组装，产生二进制的、颜色编码的荧光信号（CNP1过量时为FAM，CNP2过量时为Texas Red），无需进行样本级别的绝对定量。通过凝胶电泳和溶液相荧光淬灭确认了四聚体的形成。该检测方法可靠地检测了添加到人血清中的四种乳腺癌亚型相关miRNA的不同浓度比，并成功检测了从MCF-7细胞提取的总RNA中的内源性miRNA目标。半定量差异估计显示平均回收率为88.8%，与qRT-PCR结果一致。根据荧光与浓度标准曲线确定的检测限在SROMB检测通道中为3至64 pM，四参数逻辑校准使得差异变化能够进行半定量估计。

意义

该平台为在分子水平上直接差异检测miRNA提供了方法学基础。尽管目前的灵敏度仍高于典型的循环miRNA浓度，并且需要进一步优化，但这种方法在经过严格的临床验证后，可能有助于乳腺癌监测的比较生物标志物分析。

引言

微小RNA（miRNAs）是长度通常为18-23个核苷酸的小型非编码RNA分子，它们是转录后基因表达的关键调节因子[1]、[2]、[3]。它们参与细胞增殖、分化和凋亡等基本生物过程，其失调与癌症发病机制密切相关[3]、[4]、[5]。在乳腺癌中，某些miRNAs作为癌基因或肿瘤抑制因子，从而显著影响肿瘤的发生、进展和转移行为[6]。miRNAs的一个显著特点是它们在体液（如血浆、血清和唾液）中的高稳定性，这归因于它们被包裹在外泌体中或与Argonaute等保护性蛋白质结合[2]、[7]。这种稳定性加上它们在疾病中的特异性表达谱，使miRNAs成为诊断乳腺癌、预测预后和监测治疗反应的有希望的无创生物标志物[8]、[9]。

目前用于miRNA检测的方法包括定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）、液滴数字PCR（ddPCR）、微阵列和下一代测序（NGS）[8]、[10]。尽管qRT-PCR和ddPCR具有高灵敏度并广泛用于靶向定量，但它们存在一些局限性，如多重检测能力有限、易受分析前变异的影响以及与引物效率和标准化方法相关的偏差[1]、[11]、[12]。微阵列技术允许更广泛的分析能力，但往往由于重复性差和检测低丰度miRNA的灵敏度不足而受到限制[13]、[14]。虽然NGS能够进行全面的miRNA分析并且在发现应用中非常有效，但其临床应用受到高昂成本、复杂的生物信息学基础设施和较长处理时间的阻碍[15]。这些技术和操作上的挑战大大限制了miRNA分析在常规临床实践中的整合。

临床肿瘤学中一个迫切未满足的需求是可靠地检测miRNA的差异表达，例如治疗前后的样本差异、不同乳腺癌亚型之间的差异或患者群体间的表达差异，因为这些模式具有重要的预后和治疗价值[16]、[17]。例如，miR-21、miR-155和miR-195等miRNAs与三阴性、HER2阳性和管腔型乳腺癌亚型的治疗反应和生存结果相关[18]、[19]。然而，在传统的比较分析工作流程中，必须独立量化两个生物样本，每次测量都带有来自逆转录效率、PCR扩增偏差、标准曲线拟合误差和参考基因标准化的分析不确定性，然后事后比较所得值。当两个独立测量的浓度相减或相除时，这些个体不确定性会传递到最终的差异结果中。对于早期治疗反应监测中可能最具临床意义的小表达差异，这种传递的不确定性会降低差异结果的统计置信度。使用液滴数字PCR进行的绝对定量研究表明，乳腺癌患者体内的循环miRNA浓度在飞摩尔到低皮摩尔之间[20]、[21]、[22]、[23]，这为评估新兴检测平台提供了灵敏度基准。因此，迫切需要能够简化两个样本之间miRNA丰度比较的分析策略，特别是通过最小化多步骤独立定量工作流程中固有的累积误差[24]、[25]、[26]。

为了解决这一差距，我们提出了一种概念验证方法，从根本上重新配置了比较miRNA分析的方式。我们的方法不是进行两次独立的绝对定量测量并算术比较结果，而是在分子水平上通过四聚体中和机制进行物理比较。在这种策略中，两个样本分别与不同的捕获探针孵育以形成miRNA-探针二聚体复合物。当两种反应混合物结合时，等摩尔的二聚体会按化学计量比组装成惰性的四聚体，而来自miRNA浓度较高样本的多余二聚体会留在溶液中。这种分子水平的消除将两个样本之间的定量差异直接转换为二进制的、颜色编码的荧光输出，无需绝对定量、参考基因标准化或事后统计比较两个独立获得的测量结果。该平台的信号放大模块基于催化发夹组装（CHA），这是一种无酶的核酸电路，其中单链启动剂催化两个亚稳态发夹探针之间的杂交，形成热力学稳定的双链产物[27]、[28]。CHA因其等温操作、可编程性和与多种信号转导模式的兼容性而在生物传感应用中得到广泛应用[29]。在本研究中，我们使用两种正交的CHA电路，每种电路都标记有不同的荧光团，以选择性地检测化学计量中和步骤后剩余的miRNA-CNP二聚体。通过结合计算探针设计和严格的生化验证（包括荧光淬灭确认四聚体组装、细胞来源的RNA测试以检测目标可及性以及与qRT-PCR的基准测试），本研究旨在使用合成miRNA目标和生物RNA提取物在受控实验条件下建立四聚体中和和正交CHA检测概念的分析有效性。我们强调，这项工作代表了方法学基础；在实际临床应用之前，还需要进一步优化灵敏度和在真实临床样本中的验证。

章节片段

miRNA表达数据收集与分析

miRNA表达数据来自十项公开可用的研究（表S1）。使用模式匹配算法对亚型注释进行了标准化，并采用双算法共识方法为缺乏明确标签的样本分配高置信度的亚型预测。通过排他性和拮抗调节框架识别候选miRNAs，并与先前报告的亚型相关基因整合（表S2），并根据miRNA-mRNA

直接检测miRNA差异的探针设计原则

为了确定直接差异检测的可行性，通过全面的文献挖掘和生物信息学分析确定了四种与乳腺癌亚型特异性相关的miRNA分子（表S1–S3，图S1–S8）。根据这些miRNAs的序列，设计了相应的miR-CNPs和SROMBs探针（表S4）。miR-CNPs探针通过捕获单个样本中的目标miRNA形成特定的miRNA-CNP复合物。在混合等体积

结论

总之，本研究建立了一个基于杂交的直接差异检测微小RNA的平台，满足了乳腺癌分子监测的临床需求。核心创新在于一种基于核酸的、化学计量的1:1中和反应：通过设计CNP1-miRNA和CNP2-miRNA复合物，在混合时定量组装成惰性的mCCm四聚体，该平台将两个样本之间的定量差异直接转换为

CRediT作者贡献声明

蒲旭阳：研究、正式分析。熊娜婷：资源提供。张银梅：方法学设计。徐泰：项目管理。吴学强：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、监督、资金获取、数据管理、概念构思

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的竞争性财务利益或个人关系。

数据可用性

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致谢

我们感谢广东省基础与应用基础研究基金会（2023A1515220132）、广东省临床医学研究中心（2023B110008）和广东省医学会临床研究基金（2025JY-A1011）的财政支持。