一种双平台检测方法：通过将催化发夹组装技术与侧向流动免疫层析检测技术相结合，实现基孔肯雅病毒的快速现场检测

《Analytica Chimica Acta》：A Double-Platform Assay for Rapid and On-Site Detection of Chikungunya Virus by Integrating Catalytic Hairpin Assembly with Lateral Flow Immunochromatography Assay

　　

卢瑞杰|陈大文|陈艾|马硕|姚玉明|陈雅雅|古丽娜扎尔·阿布杜沙拉穆|周美玲|李晓|郑月|卢文静|王月琪|高迅|张晨|王继伟|吴国秋

中国江苏省南京市东南大学医学院中山医院临床实验室医学中心，邮编210009

摘要

基孔肯雅病毒（CHIKV）是一种通过蚊子传播的病原体，对全球健康构成日益严重的威胁，但现有的核酸检测方法在资源有限的环境中仍难以实施。在这项研究中，我们开发了基于催化发夹组装（CHA）的侧向流动免疫层析检测平台，通过将CHA与时间分辨荧光免疫层析检测（TRFIA）和胶体金免疫层析检测（GICA）结合来实现CHIKV核酸的检测。经过系统优化反应条件以减少背景干扰后，CHA-TRFIA的检测限达到100 fM，线性范围为100 fM至1 μM（R2 = 0.976），而CHA-GICA的视觉检测限为1 pM，线性范围也为1 pM至1 μM（R2 = 0.947）。这两种平台均能有效区分CHIKV与突变序列及其他非目标病毒序列（登革热病毒、寨卡病毒、马亚罗病毒、罗斯河病毒和辛德比斯病毒；P < 0.0001）。在盲法试验中，使用100份含有伪病毒的人血清样本（50份阳性，50份阴性），在35°C条件下，CHA-TRFIA和CHA-GICA的灵敏度分别为94%和92%，AUC分别为0.970和0.984；在室温条件下，相应灵敏度分别为92%和88%，AUC分别为0.980和0.917。两种方法在两种条件下的特异性均为100%。两种平台均在30分钟内完成检测。CHA-TRFIA适用于定量分析，而CHA-GICA更适合快速无设备视觉筛查，共同为资源有限环境中的CHIKV检测提供了实用方案。

引言

基孔肯雅病毒（CHIKV）是一种由伊蚊传播的单链正链RNA病毒，属于甲病毒属（Alphavirus），属于托加病毒科（Togaviridae）[1]，[2]。自1952年在东非被发现以来，CHIKV已传播至60多个国家，主要分布在热带和亚热带地区，并逐渐扩展到温带地区[3]，[4]，[5]。CHIKV感染会导致基孔肯雅热，其特征为急性发热、严重关节痛、皮疹和肌肉痛[6]，[7]。虽然死亡率较低，但许多患者会发展成慢性关节炎，导致持续疼痛和功能障碍，严重影响生活质量并增加医疗负担[8]，[9]。少数病例可能出现神经系统或心脏并发症[10]，[11]。目前尚无特定的抗病毒药物。疫情常发生在诊断工具稀缺的资源有限地区，这给早期诊断带来了挑战。因此，迫切需要一种快速、简单、灵敏且特异的即时检测方法。

现有的CHIKV检测方法包括病毒分离、分子检测、血清学检测和抗原检测[12]，[13]。病毒分离是确诊的金标准，但耗时且需要专门设施[14]。血清学方法如酶联免疫吸附试验（ELISA）可以检测CHIKV特异性IgM和IgG；然而，在感染早期抗体滴度较低，且交叉反应常常影响灵敏度和特异性[15]，[16]，[17]。分子方法包括逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和等温扩增技术（IAT）。RT-PCR具有高灵敏度和特异性，但依赖昂贵的仪器和训练有素的人员，限制了其在资源有限环境中的应用[18]，[19]，[20]，[21]。某些IAT方法，如环介导的等温扩增（LAMP）和链置换扩增（SDA），虽然不需要热循环，但通常需要多种酶和高反应温度，增加了成本和操作复杂性[22]。

催化发夹组装（CHA）是一种无需酶的等温扩增技术，通过目标触发的熵驱动循环自组装在两个互补的发夹结构探针之间实现信号放大[23]，[24]，[25]。作为一种无需酶的信号放大技术，CHA具有低背景泄漏和相对稳定的反应过程，并可灵活与不同的分析方法（如比色法和拉曼光谱）结合，以提高信号读数和可视化性能[26]，[27]，[28]，[29]。侧向流动免疫层析检测（LFIA）是一种基于毛细作用和膜上抗原-抗体相互作用的即时检测（POCT）方法，可实现快速、简单且经济高效的现场检测[30]，[31]，[32]。时间分辨荧光免疫层析检测（TRFIA）使用镧系标记的荧光探针进行灵敏的定量分析[33]，[34]，而胶体金免疫层析检测（GICA）利用金纳米颗粒实现快速视觉检测[35]，[36]；这两种方法均基于LFIA原理。因此，将CHA与TRFIA和GICA结合，可以同时具备无需酶的信号放大优势和LFIA的便携性，从而提高检测灵敏度和操作便利性。

在这项研究中，我们开发了两种CHA-LFIA平台：CHA-TRFIA和CHA-GICA，用于CHIKV核酸检测。CHA-TRFIA通过荧光读数实现灵敏的定量检测，并支持数字信号记录；CHA-GICA则基于金纳米颗粒的颜色变化实现快速视觉检测。与RT-PCR相比，这些双平台不需要复杂的仪器或专业人员，能够在等温条件下实现简单、低成本和快速的检测。通过结合定量分析和快速现场视觉筛查，它们为早期诊断、大规模筛查以及在初级医疗和其他资源有限环境中的应用提供了实用方案。

章节摘录

探针设计与制备

从NCBI数据库获取了完整的CHIKV基因组序列（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）。使用SnapGene软件（GSL Biotech，美国）进行序列比对，以确定nsP1基因内的高度保守区域，并选择了一个24个核苷酸的保守片段作为目标（T）。所选序列与其他蚊媒病毒和人类基因组进行了BLAST比对（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/），以确保特异性。设计了H1和H2两种发夹探针

CHA-LFIA双平台检测系统的原理

使用双平台系统的CHIKV检测整体工作流程如图1A所示。检测机制包括两个连续阶段：液相催化发夹组装（CHA）信号放大阶段，随后是固相LFIA读数阶段。

CHA的原理如图1B所示。在没有目标T的情况下，H1和H2的互补区域主要被封闭在各自的茎环结构内；因此，不会发生直接杂交

结论

多种等温扩增技术促进了CHIKV的快速即时检测（表S2）。然而，如逆转录重组酶聚合酶扩增（RT-RPA）[38]等方法严重依赖酶，增加了试剂成本和冷链要求。相比之下，作为一种无需酶的策略，CHA在试剂组成和操作便利性方面具有实际优势。其实用性已在核酸分析中得到验证[39]

CRediT作者贡献声明

郑月：软件、资源、正式分析。李晓：撰写——审稿与编辑、验证、资源管理、数据管理。张晨：研究、资金获取、正式分析、概念构思。陈艾：撰写——审稿与编辑、可视化、验证、软件、资源管理、概念构思。高迅：监督、方法学、资金获取、概念构思。陈大文：撰写——审稿与编辑、可视化、软件、资源管理、方法学

数据可用性

本研究期间未生成或分析任何数据集。

出版同意

所有作者均已阅读并批准最终稿件。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

资助声明

本研究得到了国家自然科学基金（82373781和82302609）、江苏省自然科学基金（BK20230840）、江苏省医学重点学科（实验室）培养单位（JSDW202240）、江苏省重症医学重点实验室（JSKLCCM202202015）、东南大学附属中山医院、江苏省高水平医院结对援助建设资金（zdyyxy10和zdlyg09）的支持

作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢所有为这项研究做出贡献的人士。

缩写列表

CHIKV：

基孔肯雅病毒

CHA：

催化发夹组装

TRFIA：

时间分辨荧光免疫层析检测

GICA：

胶体金免疫层析检测

ELISA：

酶联免疫吸附试验

RT-PCR：

逆转录聚合酶链反应

IAT：

等温扩增技术

LAMP：

环介导的等温扩增

SDA：

链置换扩增

LFIA：

侧向流动免疫层析检测

POCT：

即时检测

TDI：

双碱基插入目标

TDD：

双碱基缺失