《Animals and Zoonoses》：CRISPR-Cas Systems in Protozoan Parasites: A Biological-Fit Decision Framework for Cas9/Cas12a Editing and dCas-Based Regulation
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CRISPR-Cas系统已经改变了原生动物寄生虫的功能基因组学研究；然而，其基因组工程结果受到寄生虫特异性生物学和遗传背景的强烈影响。本综述聚焦于在代表性原生动物寄生虫系统中已通过实验建立的CRISPR应用，并探讨了DNA修复途径、递送架构、DNA双链断裂（D
CRISPR-Cas系统已经改变了原生动物寄生虫的功能基因组学研究；然而，其基因组工程结果受到寄生虫特异性生物学和遗传背景的强烈影响。本综述聚焦于在代表性原生动物寄生虫系统中已通过实验建立的CRISPR应用，并探讨了DNA修复途径、递送架构、DNA双链断裂（DSBs）的生物学后果以及与Cas表达相关的细胞负担如何共同塑造基因组编辑结果。研究人员总结了在原生动物寄生虫中，Cas9和Cas12a介导的基因组编辑以及基于dCas的转录调控（CRISPRi/a）的最新进展。现有证据表明，在原生动物系统中不存在普遍最优的CRISPR平台。相反，CRISPR策略的选择应基于实验目标、靶基因特性和物种特异性生物学特征。基于Cas9和Cas12a的系统在靶向基因破坏和内源标签方面仍然具有优势，而DSB非依赖性的调控方法（如dCas介导的CRISPRi/a）可能为对DNA损伤高度敏感的寄生虫提供生物学上破坏性较小的替代方案。新兴的RNA靶向、精准编辑和紧凑型RNA引导效应子可能进一步扩展原生动物遗传工程工具箱，尽管其中大多数仍处于早期开发阶段。总体而言，原生动物寄生虫中的CRISPR应用正从以工具为中心的模式向基于生物学信息和决策导向的原生动物基因组工程框架转变。
论文主体部分内容总结如下：
**1. 引言**：原生动物寄生虫病持续对全球公共卫生和社会经济发展产生重大影响，代表性疾病包括疟疾、利什曼病、锥虫病、隐孢子虫病和弓形虫病。这些寄生虫在系统发育、细胞结构和生命周期阶段上高度多样化，但均具有复杂的宿主适应机制和精细调控的基因表达网络。由于基因组结构紧凑、基因间区短、染色质景观非经典以及转录调控模式独特，许多原生动物寄生虫的遗传操作面临挑战。DNA修复途径（如非同源末端连接（NHEJ）、同源重组（HR）、微同源末端连接（MMEJ））的缺失或差异也显著影响CRISPR编辑结果。CRISPR-Cas系统的出现为原生动物功能基因组学提供了突破性工具，但其应用仍需系统评估生物学适配性。
**2. Cas9和Cas12a系统在原生动物寄生虫基因组编辑中的应用与局限**：Cas9是应用最广泛的CRISPR核酸酶，通过RNA引导引入位点特异性DNA双链断裂（DSBs），依赖宿主DNA修复途径实现基因敲除或序列整合。Cas12a（Cpf1）产生带有5′突出端的交错断裂，具有不同的PAM序列和无需tracrRNA的特点，但在原生动物中未根本改变核心限制。DSBs在原生动物中具有更高的生物学代价，因为许多物种基因组高度基因密集、修复途径不完全，易导致细胞生长停滞或死亡。Cas9和Cas12a系统的适用性取决于实验目标、靶基因必需性、宿主修复能力及细胞耐受性。对于必需基因，直接敲除常失败，而DSB非依赖的调控策略是重要替代。
**3. CRISPR-Cas系统在原生动物寄生虫中的递送与编辑实施策略**：成功编辑取决于递送架构、修复生态（DNA修复途径组成和利用）和基因组架构三者的组合。递送策略包括基于质粒的Cas/gRNA共表达、核糖核蛋白（RNP）直接递送及混合策略。质粒介导的稳定表达可能带来细胞毒性，如阴道毛滴虫和克氏锥虫中Cas9持续表达影响生长；RNP递送减少持续压力但递送效率依赖实验参数。DNA修复途径方面：HR主导的寄生虫（如疟原虫）需供体模板；NHEJ或MMEJ主导的（如锥虫、利什曼原虫）可产生插入缺失突变；修复途径缺失的（如蓝氏贾第鞭毛虫）编辑效率低。编辑结果类型包括敲除、敲入、标签融合，但多倍体或非整倍体导致镶嵌编辑和部分编辑群体。验证需结合基因组、转录、蛋白及表型多层面分析。
**4. CRISPR技术在原生动物寄生虫基因功能研究中的应用**：从单一基因敲除扩展到多功能平台。包括：基因敲除与功能丧失分析，在依赖HR的系统中通过HDR促进精确替换；必需基因的条件干预策略，结合诱导型系统或CRISPRi实现可逆调控；内源蛋白标签与亚细胞定位研究，通过精准插入荧光蛋白或表位标签在天然调控背景下监测蛋白；精细功能解析与结构-功能关系研究，通过供体模板介导的HDR引入点突变、结构域截短等；高通量功能筛选，通过sgRNA文库进行群体筛选，但在许多原生动物中仍受限于复制慢、转染通量低等。
**5. 基于dCas的转录与表观遗传调控策略**：催化失活的dCas保留靶向结合能力但不切割DNA，适用于必需基因和剂量敏感基因。CRISPRi通过dCas与sgRNA结合阻断转录起始或延伸，在蓝氏贾第鞭毛虫和弓形虫中展现出稳定可预测的抑制作用，gRNA靶位点选择靠近转录起始位点（TSS）时效果最佳。CRISPRa在原生动物中探索有限，因转录激活依赖物种特异性因子，且某些原生动物（如锥虫）缺乏经典启动子结构。潜在应用超越转录水平，包括通过融合组蛋白乙酰转移酶或去乙酰化酶实现表观遗传调控，但需谨慎解释非特异性染色质效应。新兴的RNA靶向（Cas13）、碱基编辑和引导编辑系统在原生动物中尚未广泛建立，但有潜力提供更精准、低毒性的遗传扰动。
**6. Cas蛋白负担、细胞毒性与系统稳定性**：Cas蛋白本身并非中性工具，其持续表达在原生动物中引发蛋白质折叠、降解及核定位压力。实验评估需测量寄生虫生长动力学、转染后存活率、Cas蛋白丰度及长期培养中编辑表型的维持。长期培养中编辑可能因不完全编辑等位基因扩增、染色体重排或选择压力减弱而丢失，或出现补偿性突变和适应性重塑。失败案例表明，许多CRISPR实验失败源于Cas系统与寄生生物学特征的结构性错配。紧凑型RNA引导系统（如Cas12f、IscB、TnpB、TIGR-Tas）虽仍处早期阶段，但因其较小分子尺寸可能降低负担，为未来开发低负担平台提供方向。
**7. 原生动物寄生虫中CRISPR应用的决策框架**：不存在适用于所有原生动物和所有研究问题的单一最优Cas系统。选择应基于研究问题：对于非必需基因，基因组敲除或敲入直接有效；对于必需基因，CRISPRi等可逆调控更适用。结构研究宜用内源标签，调控研究宜用转录水平扰动。物种特异性特征包括生长速度（快生长如疟原虫和弓形虫可部分缓解毒性，慢生长如蓝氏贾第鞭毛虫和锥虫需低负担策略）和代谢状态（微需氧或厌氧寄生虫对蛋白质表达和DNA损伤敏感）。综合决策应考虑实验目标、靶基因属性（必需性、剂量敏感性）和物种生物学特性（生长速率、代谢类型、DNA修复偏好）。
**8. 展望与未来方向**：未来方向包括开发紧凑、低负担的Cas蛋白变体；构建诱导型与条件性CRISPR系统以实现时空精确调控；推进高通量功能筛选，尤其依赖低破坏性和可逆的转录调控策略（如CRISPRi）以减少适应性补偿。最终，CRISPR平台的设计应以寄生虫特异性生物学特征为基本原理，而非视为技术障碍。
**9. 结论**：CRISPR-Cas技术已根本改变了原生动物功能基因组学研究深度，但CRISPR并非通用工具集。Cas9和Cas12a介导的基因组编辑在弓形虫和疟原虫等系统中优势明显，但在DNA修复能力有限或对损伤敏感的物种中，DNA双链断裂（DSBs）带来显著生物学代价。基于dCas的转录和表观遗传调控策略（如CRISPRi）在必需基因研究和避免DNA损伤压力方面展现独特价值。Cas蛋白的表达负担和核定位效率与寄生虫有限的蛋白质稳态能力相互作用，影响系统稳定性。基于此，提出了以决策为导向的整合框架，强调实验目标、靶基因属性和物种特征的综合考虑。未来应沿着生物学中心框架发展，包括紧凑Cas蛋白、优化递送系统、标准化验证流程和低负担转录扰动系统。可逆和最小破坏性的调控系统有望加速原生动物致病机制解析和治疗脆弱性发现。
