综述：基于CRISPR的基因组工程方法在豆科植物中的应用与优势

《Cogent Food & Agriculture》：Application and advantages of CRISPR-based genome engineering approaches in legumes

　　

最近的基因组编辑技术利用TALEN（转录激活因子样效应核酸酶，transcription activator-like effector nuclease）、ZFN（锌指核酸酶，zinc finger nuclease）和CRISPR/Cas9（成簇规律间隔短回文重复/CRISPR相关蛋白9核酸酶，clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated protein 9 nuclease）系统，为不同豆科物种提供了便捷的基因编辑工具。这些技术可被推广以增加豆科作物产量，而豆科作物产量因极端环境条件和气候变化情景而自然受限。这三种基因组编辑工具（TALEN、ZFN和CRISPR/Cas9）已成功在苜蓿（Alfalfa）、百脉根（Lotus japonicus）、大豆（soybean）、豇豆（cowpea）、鹰嘴豆（chickpea）和花生（peanut）等豆科物种中尝试，涉及多个性状，如结瘤、抗病性、油酸含量和共生固氮。然而，豆科植物基因组编辑因缺乏常规基因编辑方法而受到瓶颈制约，原因是豆科植物转化和植株再生方案在不同物种间缺乏稳健性、可重复性和可靠性。研究人员需要对成功案例和障碍进行批判性讨论，以更新知识并开发适用于不同豆科物种的标准化、稳健方案。本综述旨在展示基于CRISPR的基因组工程方法在不同豆科植物中的应用与优势。此外，还贯穿了豆科植物的有益方面：经济、社会、环境和土壤健康。本综述批判性地讨论了可持续豆科作物生产的挑战和局限性，并进一步联系了先进基因编辑方法（如碱基编辑（base editing）、引物编辑（prime editing）和CRISPR-Cas13）带来的变革。不同豆科植物基因组编辑方法的成功案例和瓶颈的批判性分析不仅将为解决现有缺陷奠定基础，还将提出弥合差距的可能途径，以在未来农业实践中增加豆科作物产量。

本文以“基于CRISPR的基因组工程方法在豆科植物中的应用与优势”为主题，系统综述了豆科植物基因组编辑技术的发展现状、成功案例及未来展望。以下按照原文小标题顺序进行总结。

**1. 引言（Introduction）**
全球人口预计到2050年将达约96亿，粮食安全与膳食蛋白质短缺成为核心挑战。豆科植物因其在间作、轮作中的土壤微生物富集、生态平衡维持及与谷物的互补性而备受重视，尤其适合低投入农业系统。豆科植物具有高固氮能力、低温室气体（GHG）排放（如CO₂和N₂O）、土壤碳封存及害虫循环打破等环境优势，被视为保护性农业的潜力作物。

**2. 豆科作物与经济、环境健康（Legume crops for economic, environmental health）**
豆科作物占据全球耕地约14.5%，年产值约20亿美元，提供复杂碳水化合物、黄酮类、异黄酮、木脂素和多酚等营养资源。其种子富含可食用蛋白，如大豆、鹰嘴豆、豇豆等。豆科作物（如羽扇豆、苜蓿和三叶草）还可作为绿肥、动物饲料及蛋白源。此外，部分豆科植物可用于木材、医药、单宁、树胶及杀虫剂（如鱼藤酮）。在环境方面，豆科作物可在缺水、贫瘠土壤中生长，通过释放高质量有机质改善土壤健康，并比冬小麦和油菜等作物减少5-7倍的GHG排放。其根系固氮能力可降低NH₃生产中的CO₂排放，而根瘤呼吸释放的CO₂高于固氮过程。欧洲生命周期评估显示，豆类全球变暖潜力（GWP）仅为0.50-0.51 kg CO₂ eq kg^-1产品。

**2.1 豆科作物与土壤健康（Legume crops for soil health）**
豆科与非豆科作物轮作可持续提高产量和质量，尤其与水稻或小麦等谷物轮作时效果显著。产量提升归因于土壤有机质、磷酸盐吸收、持水能力改善及杂草和病害减少。豆科作物通过提供有机碳（C）和氮（N）增加土壤有机碳，固氮副产物氢气（H₂）促进根瘤发育。豌豆在增加土壤有机碳方面最有效，大豆与玉米以3:2比例间作效果最佳。豆科植物显著提高土壤氮素有效性，根系固氮可达地上部氮的50%。蚕豆或白羽扇豆的根际可影响可提取有机磷池，但磷活性组分的比例因物种而异。

**3. 气候条件变化带来的益处与挑战（Benefits and challenges due to erratic climatic conditions）**
豆科作物生命周期60-90天，最适生长在热带气候（25-35°C，降水550 mm）。需排水良好的土壤，避免碱性和盐渍土。种子易感真菌病害，需杀菌处理。推荐用Bradyrhizobium或Pseudomonas菌株接种。种植密度需达每平方米30株，每4-5天灌溉一次，荚成熟后停止。豆科作物属于地上发芽，需高土壤湿度；不同发育阶段受光周期和温度调控，非同步开花和多次收获影响干物质分配。叶面积指数需遮挡90%入射光。狭窄叶片比宽叶片产量更高。涝渍是关键限制因子，干旱影响结荚。热害和干旱是全球主要挑战。此外，种植面积有限，可通过横向扩展与纵向间作解决。蛋白质含量因品种、栽培方法而异，且与产量、种子大小和含油量呈负相关，需通过传统育种与生物技术提高。

**3.1 豆科基因组学与基因组编辑应用的障碍（Impediments to legume-genomics and legume-genome editing applications）**
三种基因组编辑工具（TALEN、ZFN、CRISPR/Cas9）为豆科植物提供了便利，但豆科植物基因组编辑受限于缺乏常规方法，因转化和再生方案在不同物种间不可靠。特定源组织（如子叶、下胚轴或胚轴）才具转化和再生能力，成熟组织常缺乏全能性。体外生根是主要障碍。大部分谷类豆科植物（如菜豆Phaseolus vulgaris）因基因型依赖性强、酚氧化严重、体细胞胚发生成功率低及对农杆菌介导基因转移低感受性而难以再生。传统转化方案效果不佳。CRISPR技术中还存在靶向效率、脱靶能力、gRNA设计和Cas9蛋白选择等问题。超声辅助农杆菌转化和基因枪方法需进一步验证。CRISPR/Cas9在大豆、鹰嘴豆、扁豆和苜蓿中已成功试验，结合高重现性再生方案有望提高成功率。

**4. 通过基因组工程实现豆科基因组学革命（Revolution in legume genomics through genome engineering）**
传统系谱法结合表型选择在过去半世纪中通过高通量基因组学技术取得最大遗传改良。分子标记辅助选择和精准基因编辑提升了优良品种产量。单核苷酸多态性（SNP）和基因组编辑使单倍型特异性基因研究成为可能。百脉根、大豆和蒺藜苜蓿的全基因组测序推动了多倍体水平变异克服。近来黑绿豆、普通菜豆、绿豆和豌豆也完成基因组测序。传统育种受限于长周期、自花传粉和多基因复杂性，而CRISPR-Cas9等基因组编辑技术提供了高精度和速度的平台。

**4.1 锌指核酸酶（ZFNs）：第一代工具（Zinc finger nucleases (ZFNs): first generation tool）**
ZFN由锌指基序组成的DNA结合域和Fok1限制酶的DNA切割域构成。每锌指基序识别三个碱基对。两个ZFN结合DNA后，Fok1二聚化诱导双链断裂（DSB），通过NHEJ或HDR修复。ZFN在豆科植物中应用有限，主要由于蛋白工程复杂性和靶点灵活性差。在大豆中，ZFN成功编辑了脂肪氧化酶基因GmLox1和GmLox2，降低“豆味”并改善风味。还编辑了DICER-LIKE基因DCL4a/b以促进侧根发育。但除大豆外，其他豆科（如鹰嘴豆、豇豆、花生）尚无成功报道，主要受限于基因组复杂性、转化低效和脱靶风险。ZFN最终被CRISPR/Cas系统取代。

**4.2 转录激活因子样效应核酸酶（TALENs）：精确但复杂（Transcription activator-like effector nucleases (TALENs): precision with complexity）**
TALEN由可定制的TALE蛋白（模块化重复识别单个核苷酸）与Fok1切割域融合组成。相比ZFN，具有更高靶点灵活性和准确性。但TALE蛋白长且重复，递送困难。在大豆中，TALEN靶向脂肪酸去饱和酶基因FAD2-1A和FAD2-1B，使油酸含量从约20%升至近80%，亚油酸降至4%以下，且突变可遗传。还靶向八氢番茄红素脱氢酶基因GmPDS11和GmPDS18，但再生植株多为嵌合体，遗传不稳定。在花生中，TALEN靶向AhFAD2基因，油酸含量适度增加（突变频率约4-9%）。TALEN因设计繁琐和转化困难而逐渐被CRISPR/Cas取代。

**4.3 CRISPR-Cas9：植物基因组工程革命（CRISPR-Cas9: the revolution in plant genome engineering）**
CRISPR/Cas9系统基于细菌防御机制，使用单链引导RNA（sgRNA）引导Cas9蛋白在互补DNA序列处引入DSB。需要Cas9核酸酶和sgRNA，识别依赖PAM序列。DSB通过NHEJ或HDR修复实现基因破坏或精确变化。变体包括Cas12a/Cpf1、Cas12b及工程化Cas9。碱基编辑器（BE）和引物编辑器（PE）可实现无DSB的单核苷酸改变。胞嘧啶碱基编辑器（CBE）和腺嘌呤碱基编辑器（ABE）分别实现C-G到T-A和A-T到G-C转换。引物编辑（如PPE2、3、3b）在水稻中效率达17%，小麦中达1.4%。

**5. 不同农艺性状的豆科基因组编辑成功案例（Legume-genome editing success stories for different agronomic traits）**
- **蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）**：作为模式植物，CRISPR/Cas9实现GUS基因55%失活；靶向MtPDS基因产生32个白化表型转化株；通过GWAS和CRISPR/Cas9鉴定控制结瘤的候选基因（如PHO-like、Penetration 3-like）；编辑SUPERMAN基因（MtSUP）研究花发育；敲除CYP93E2和CYP72A61改变皂苷代谢，效率84%。
- **百脉根（Lotus japonicus）**：使用毛根转化法成功编辑共生固氮基因；敲除LjCZF1减少感染线数和根瘤数；敲除豆血红蛋白（Lbs）研究根瘤衰老；敲除CYP716A51减少三萜类C-28氧化。
- **大豆（Glycine max）**：高经济价值，编辑最广泛。通过毛根转化和农杆菌法实现多位点编辑：靶向GmLox1/2/3去除豆味；编辑GmSPL9基因缩短节间长度、增加分枝节点；编辑贮藏蛋白基因Glyma20g148400等改变蛋白组分；编辑AGO7基因影响叶片模式；靶向KAS1改变蔗糖向油转化；高通量编辑102个候选基因获得407个T0突变体，突变频率59.2%；编辑GmFT2a和GmFT5a延迟开花；编辑E1、GmPRR37控制光周期；编辑FAD2-2提高油酸至73.5%；靶向DD20、DD43、ALS1实现抗除草剂突变，NHEJ和HDR效率分别为59%和76%。
- **豇豆（Vigna unguiculata）**：2019年起应用CRISPR/Cas9，通过毛根转化编辑共生固氮基因SYMRK，抑制结瘤；使用GmEF1A2启动子和VuU6启动子提高转化效率至37%，靶向SPO11-1。
- **鹰嘴豆（Cicer arietinum）**：编辑抗旱基因4CL和RVE7（原生质体系统）；通过基因枪递送编辑DREB1A提高抗旱性；草香豌豆（Lathyrus sativus）编辑OCS基因影响草酸代谢。
- **花生（Arachis hypogaea）**：靶向AhFAD2提高油酸含量；TALEN诱导10 bp缺失使油酸翻倍、亚油酸降至3%；靶向AhFAD2B减少亚油酸；编辑过敏原基因Ara h2；靶向Nod因子受体AhNFR1和AhNFR5获得无结瘤表型。

**6. 基因组编辑谷类豆科植物的监管方面（Regulatory aspects of genome edited grain legumes）**
多国政府推动豆科作物发展，但监管是主要障碍。新西兰、欧洲和印度采用过程驱动监管；美国、阿根廷、加拿大和澳大利亚基于最终产品。俄罗斯计划开发30种GE植物/动物且不纳入田间试验。位点定向核酸酶SDN-1产生的GE作物在部分国家不受GMO法规约束，印度已豁免SDN1和SDN2产品。欧盟则严格监管。SDN1产生的短插入/缺失不含外源DNA，有利于社会接受。需进行生态风险评估以防基因污染、遗传侵蚀和土壤微生物失衡。

**7. 结论与未来展望（Conclusion and future aspects）**
豆科植物富含蛋白质和植物化学物质，适合现代种植体系。全基因组序列信息为培育适应性品种提供支持。CRISPR/Cas9及先进工具如Cpf1、碱基编辑（BE）和引物编辑（PE）在花生、鹰嘴豆、豇豆原生质体中已优化（PE效率0.2-0.5%）。CRISPR-Cas13有望精确对抗RNA病毒。毛根转化结合CRISPR/Cas9可提高难转化豆科植物的效率。可通过添加硝酸银（AgNO₃）、抗氧化剂、特定生长调节剂或使用易转化物种（如P. acutifolius）克服菜豆的顽拗性。应用形态发生调节因子如Baby boom（BBM）和Wuschel（WUS）可促进体细胞胚发生。诱导型启动子、人工模拟天然抗病多态性（生物模拟）等策略可提高编辑效率。需加强再生与转化方案、减少脱靶、增强HDR及可靠筛选程序。广泛田间试验需确认外源DNA消除。GE豆科植物结合育种计划有望显著提高产量与胁迫耐受性，最终支持可持续农业。