综述：单核细胞增生李斯特菌在食品工业中的生存与适应：持久性机制解析

《Food Reviews International》：Survival and Adaptation of Listeria monocytogenes in the Food Industry: Insights into Persistence Mechanisms

　　

单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一种广为人知的食源性病原体，可引发严重的人单核细胞增生李斯特菌病（listeriosis），该病主要累及免疫功能受损人群及其他基础疾病患者，如老年人与孕妇。该微生物因对多种不利条件具有抗性，可在食品加工环境中持续存在，构成重大食品安全隐患。因此，深入解析驱动这种持久性的影响因素，包括该微生物在食品加工设施内抵御严苛环境的通路至关重要。本综述系统探讨了单核细胞增生李斯特菌菌株的生存机制，以及当前用于分析其独特持久性行为的方法学。文中回顾了基因组学与计算生物学方法的最新进展，强调这些方法在提升食品加工环境中单核细胞增生李斯特菌持久性的鉴定、表征与预测能力方面的潜力。阐明这些机制对于制定可在食品工业中有效实施的控制策略具有重要意义。

引言

单核细胞增生李斯特菌是文献充分记载的兼性厌氧革兰阳性杆菌，广泛存在于土壤、水等多样环境中，可通过摄入污染食品直接导致发病率低但致死率高的单核细胞增生李斯特菌病，高危人群感染后重症风险尤为突出。该食源性病原体生长温度范围为0°C至45°C，pH耐受区间为4.1至9.6，最低生长水活度（a_w）可达0.90，因而可在食品中长时间存活。作为胞内病原体，单核细胞增生李斯特菌能够侵袭上皮细胞等多种细胞类型，并靶向肝脏等器官。在免疫受损个体中，该病原体可诱发脑膜炎、败血症等致死性疾病；在孕妇群体中则可能导致早产或流产。根据欧洲食品安全局（EFSA）人畜共患病报告数据，2024年共报告3041例确诊人类单核细胞增生李斯特菌病病例，该疾病住院率与死亡率均居食源性疾病前列，且自2020年以来呈显著上升趋势。同一报告指出，在分销环节，发酵肉制品（如发酵香肠）是单核细胞增生李斯特菌阳性样本的主要来源。单核细胞增生李斯特菌通过交叉保护、胁迫耐受、生物被膜形成等生理特性在食品和饲料加工环境（FFPE）中持久存在，是食品安全领域的重大挑战，也是单核细胞增生李斯特菌病暴发的重要诱因。当前，由特定耐受基因的存在或生物被膜形成能力介导的、对FFPE常用消毒剂（如季铵化合物QACs）的微生物耐受现象已成为全球关注焦点。在FFPE中，单核细胞增生李斯特菌常在地面、排水沟、传送带及刀具、研磨机、切片机等器具表面检出。这些表面的污染是该微生物在FFPE内扩散的主要途径，可通过将单核细胞增生李斯特菌从生态位转移至食品接触面或直接污染产品，不仅给消费者带来严重的健康危害，也会导致生产者遭受重大经济损失。尽管业界已采用乳酸菌、紫外线辐射、表面活性剂等多种策略控制或预防污染，但该微生物在工业环境（尤其是难以清洁的区域）的持续存在仍是日益严峻的公共卫生问题。鉴于其毒力及对高风险人群的威胁，对单核细胞增生李斯特菌开展涵盖流行率、污染源与传播途径的监测至关重要。理解赋予其环境韧性的机制同样关键。因此，本综述整合生理学、基因组学与生态学视角，将持久性作为一个多因素现象进行系统阐释，内容按逻辑分为若干章节，结构化呈现单核细胞增生李斯特菌持久性的核心要点：明确其持久性的定义，解析有助于该微生物适应食品工业环境的调控机制与适应策略，梳理当前用于分析单核细胞增生李斯特菌持久性菌株的基因组方法与生物信息学工具。最终，本综述聚焦于未来研究方向的关键点与现存挑战，强调需要采用整合的、以生态驱动的视角，以更好地理解并控制工业场景下的单核细胞增生李斯特菌持久性问题。

单核细胞增生李斯特菌持久性

单核细胞增生李斯特菌对高盐浓度、低温、低pH值、杀菌剂或重金属暴露等严苛环境条件具有卓越的耐受能力，且在这些胁迫下可能诱导持留菌（persister cells）形成。这些机制可能与部分单核细胞增生李斯特菌菌株在FFPE中长期存活的非凡能力直接相关，这种规律通常被定义为持久性。需要注意的是，“持留菌（persister）”与“持久性（persistent）/持久性（persistence）”常被混用，二者实际指代不同概念，常发生误用。

持留菌形成

正如Serrano等人近期综述所界定，“持留菌”是指能够耐受致死浓度抗菌剂暴露的细菌亚群。重要的是，此类细胞在该条件下保持非复制状态，使其能够在致死处理中存活。这与“耐药（resistant）”细菌存在本质区别：耐药菌种群在药物存在下既可存活又可增殖，其耐受上限由最小抑菌浓度（MIC）决定。与耐药性（可通过多种遗传机制从亲代种群遗传或获得）不同，持留菌在脱离抗菌剂环境后重新培养时，对药物的敏感性与亲代种群一致。此外，随着抗生素浓度升高或特定浓度暴露时间延长，持留菌形成可通过双相杀灭曲线识别：敏感细胞快速死亡，持留菌逐渐成为优势种群，整体杀灭速率进入平台期。持留菌形成主要通过两类独立机制启动，分别称为I型和II型亚群。I型持留菌被描述为在稳定期响应环境因素（如抗生素存在）产生的非生长、代谢休眠细胞；II型持留菌则是在总种群中持续产生的慢生长细胞，不受外部因素影响。已有研究观察到单核细胞增生李斯特菌在暴露于庆大霉素、诺氟沙星、乳酸链球菌素等高浓度特定抗菌剂后形成持留菌。其他食源性病原体（包括蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌）也被报道在诱导刺激暴露后形成持留菌。因此，单核细胞增生李斯特菌持留菌可被触发作为一种适应机制，潜在促进该食源性病原体在FFPE中的持久存在，但需注意持留菌形成本身并不等同于持久性。

持久性与泛在性单核细胞增生李斯特菌

EFSA将单核细胞增生李斯特菌、肠炎沙门氏菌和阪崎肠杆菌列为FFPE中最具持久性意义的三种食源性细菌病原体。文献中将单核细胞增生李斯特菌持久性菌株定义为：在不同时间点从同一来源或环境中重复分离、经表型或基因型工具鉴定为相同亚型（subtype）的菌株。与之相对，“非持久性”或散发性菌株指从同一来源偶尔分离、且亚型特征独特的菌株。Finn等人提出了简化且标准化的持久性定义，将其描述为6个月及以上时间内两次或以上分离到相同亚型的菌株。根据其研究结论，统一规范的持久性定义对于可靠比较不同研究结果至关重要，这需要高分辨力的分型方法与准确的分离技术共同支撑。早期研究已对单核细胞增生李斯特菌持久性定义的规范性提出过类似关切。“泛在性单核细胞增生李斯特菌（pervasive L. monocytogenes）”这一表述被引入以界定一类特殊的持久性：指从不同食品加工设施与环境分离到的遗传相似菌株。我们认为，未来的单核细胞增生李斯特菌持久性研究应逐步同时纳入“持久性菌株”与“泛在性菌株”两类术语，以区分局限于单一设施的菌株与跨不同地点检出的遗传相似菌株。鉴于单核细胞增生李斯特菌广泛存在于自然环境中，且可在人类与动物体内无症状携带，泛在性菌株在食品链中的流行程度可能比当前认知更为普遍。

单核细胞增生李斯特菌适应机制

单核细胞增生李斯特菌表现出卓越的抗逆能力与细胞调控改变能力，使其可在胁迫条件下持续存在。多种机制直接关联该微生物的适应能力：σ^B（Sigma因子B）的上调、特定质粒（如pLM58）与胁迫相关蛋白（如ClpL）、硫醇二硫化物氧化还原酶及外排泵的表达，共同贡献其对低pH、高温、氧化胁迫及抗菌剂的耐受性。此外，冷休克蛋白（CSPs）等参与基因调控的蛋白，通过调控分子与生物学响应机制，在单核细胞增生李斯特菌的生存中发挥关键作用。响应环境条件的细胞重排也会发生，包括促进氧化胁迫防御、脂肪酸生物合成及单核细胞增生李斯特菌细胞壁的其他适应性改变。表面相关内化素（Inls）虽不直接关联持久性，但可能在生物被膜形成过程中增强黏附能力，提供一定的环境韧性优势。除上述功能外，单核细胞增生李斯特菌可形成生物被膜，保护群落内的细胞免受环境胁迫。针对生物被膜的处理还可能诱导其进入活的不可培养（VBNC）状态，进一步促进其在食品加工环境中的持久存在。近期研究表明，铜绿假单胞菌等微生物与单核细胞增生李斯特菌共存于生物被膜时，可增强后者对苯扎氯铵（BAC）等消毒剂的抗性，这进一步凸显了控制FFPE中生物被膜形成的重要性。基于上述因素，本综述选取了5种促成单核细胞增生李斯特菌持久性的核心机制展开系统评估。

交叉保护（CP）

已知反复暴露于过氧乙酸等抗菌剂会提升单核细胞增生李斯特菌的耐受性，需要更高浓度才能达到同等抗菌效果。这类暴露可诱导适应性响应，增强其在胁迫下的存活能力，还可能赋予对其他不利条件的交叉保护。这种胁迫耐受与交叉保护机制共同提升了单核细胞增生李斯特菌在连续或重复胁迫下的环境韧性。Lundén等人报道，当2株持久性与2株非持久性单核细胞增生李斯特菌菌株暴露于不同消毒剂的亚致死水平时，彼此间产生了交叉适应性响应。研究人员观察到其中一株持久性菌株的最小抑菌浓度（MIC）值高于非持久性菌株。值得注意的是，过硫酸钾是唯一未诱导交叉适应的化合物，尽管其暴露可触发针对其他受试消毒剂的交叉抗性。Yu等人也报道了类似规律：单核细胞增生李斯特菌菌株暴露于递增剂量的常用消毒剂BAC后，不仅对BAC的抗性升高，对头孢他啶、头孢噻吩等其他抗菌剂的耐受性也同步提升。Bland等人也观察到交叉保护能力：将该食源性病原体暴露于季铵化合物（QACs）类商业消毒剂的亚致死浓度后，其对7种不同抗生素的敏感性降低。过氧乙酸或聚乙烯吡咯烷酮碘等杀菌剂的亚抑制浓度，似乎也会影响固着态（即多细胞生活阶段）单核细胞增生李斯特菌细胞对氯霉素、四环素等的敏感性。然而，部分适应性响应及其交叉效应可能直接受温度等因素影响。例如Shen等人报道，在pH 5.0、37°C条件下生长1小时的酸适应单核细胞增生李斯特菌细胞，若在pH 7.2条件下培养24小时后，其在4°C下的酸耐受性仍可保留，但在22°C或37°C下则无法保留；而预先低温暴露并不能提升微生物对酸胁迫的耐受性。该研究还表明，酸适应细胞若在酸性条件培养后立即暴露于致死剂量月桂酰精氨酸乙酯，可表现出交叉保护；但这种抗性在4°C放置60分钟后完全丧失，即便酸适应状态仍保持稳定。研究人员提出，不同细胞韧性提升与潜在交叉保护的机制，其稳定性存在差异。这些发现对FFPE具有重要参考价值：单核细胞增生李斯特菌在日常生产中持续面临温度波动与多样环境胁迫，这直接影响适应性响应的稳定性与抗菌干预的效果。已知低温生长可通过膜脂肪酸组成改变等细胞修饰实现，这些调整可能干扰单核细胞增生李斯特菌同时应对食品加工场景中常见环境胁迫的能力，包括消毒剂暴露、温度波动、渗透压或防腐剂存在等。这是评估潜在交叉保护的重要局限：此类效应可能在实验室条件下可检测，但在温度或暴露时长等可变环境参数下可能消失。需要进一步研究对比持久性与非持久性单核细胞增生李斯特菌菌株的交叉保护能力差异，明确是否存在表型区别。由于亚致死浓度消毒剂暴露可能导致对同类化合物及其他抗菌剂的更高耐受性，未来研究应仔细评估这些变异，尤其需要考虑温度在适应性响应的产生与维持中的作用。在分子层面，这类适应性响应通常由σ^B等转录调控因子协调，下文将对此展开讨论。

σ因子B（σ^B）

σ因子是一类负责调控子（regulons）与管家基因激活的转录调控因子，对单核细胞增生李斯特菌的毒力与胁迫响应具有明确影响。该微生物中共鉴定出5种σ因子，包括σ^A、σ^B、σ^C、σ^H与σ^L。其中σ因子B（σ^B）的研究最为深入，不仅因其调控单核细胞增生李斯特菌的环境韧性与通用胁迫响应，还因其参与正调控因子A（PrfA）的调控，直接影响该病原体的毒力。Becker等人证实，σ^B缺失的单核细胞增生李斯特菌突变株在3%氯化钠暴露后甜菜碱积累能力远低于野生型菌株，这种对σ^B的依赖性在高盐（1.75 M氯化钠）与酸性（pH 2.5）条件下的细菌生长中同样存在。有趣的是，该突变株在0.5 M氯化钠条件下的生长能力优于亲本菌株，研究人员认为这可能是不利条件下关键代谢通路的改变所致，这一现象在其他细菌中也曾有报道。值得注意的是，有研究报道σ^B缺失会导致单核细胞增生李斯特菌在有氧条件下对过氧化氢产生超强抗性，这进一步印证了σ^B调控在提供保护机制方面的潜在作用——在此案例中是通过促进氧化胁迫防御实现的。Wemekamp-Kamphuis等人进一步探究了σ^B在酸胁迫中的作用，发现敲除σ^B后菌株在pH 2.5条件下的存活率显著降低，与野生型菌株相差5个对数单位；预暴露于非致死pH 4.5仅轻微提升存活率，提示存在不依赖σ^B的保护机制激活。Ferreira等人也观察到类似结果：无论是否预先适应pH 4.5，σ^B突变株在pH 2.5条件下的抗性均更低，且在模拟胃液中存活率下降。总体而言，该环境下的存活能力与生长阶段相关，稳定期存活能力更强，且部分依赖σ^B。另一项类似研究同样证实了σ^B在酸性条件（pH 2.5）、氧化胁迫与碳饥饿胁迫下单核细胞增生李斯特菌存活能力中的重要性，但突变株与野生型菌株在高温（50°C）或乙醇（16.5%，v/v）胁迫下的存活率无显著差异。一项针对46921株单核细胞增生李斯特菌基因组的大规模分析鉴定出两种σ^B变体，分别为σ^B_T1与σ^B_T2，分别与谱系I/III和谱系II相关。研究人员推测σ^B_T1可能贡献了谱系I和III在环境中观察到的更强侵袭力、毒力与持久性，有望成为该病原体流行病学分布的有用标志物。综上，σ^B似乎与单核细胞增生李斯特菌在不利环境条件下的存活密切相关，因此可能在其持久性中发挥关键作用。但仍需更多研究阐明σ^B如何具体促成FFPE中的持久性，以及持久性与非持久性菌株在该条件下是否存在差异。由于σ^B调控通用胁迫响应并影响外排系统等适应机制，该因子的激活可能是单核细胞增生李斯特菌持久性的关键性状。

外排泵（EPs）

细菌外排泵（EPs）是一类能够将各类化合物（如抗生素）从胞内转运至胞外的转运蛋白，是介导多重耐药的重要机制。鉴于其重要性，抑制外排泵已被提议作为降低耐药性、毒力与生物被膜生成的策略。在单核细胞增生李斯特菌中，抑制这些系统不仅会减少毒性化合物的排出，还会影响鞭毛形成、侵袭力及毒力相关蛋白的产生。文献中报道的单核细胞增生李斯特菌两种经典外排泵为MdrL与Lde，分别在苯扎氯铵（BAC）抗性、环丙沙星等抗生素抗性中发挥关键作用。Romanova等人评估了8株单核细胞增生李斯特菌（4株BAC耐药株、4株BAC敏感株），发现敏感株暴露于亚致死BAC浓度后，与BAC抗性相关的mdrL基因表达上调；尽管lde基因已知参与氟喹诺酮类抗性，但研究中未观察到其表达差异。有趣的是，加入外排泵抑制剂利血平可降低敏感株的MIC值，但对耐药株无影响，提示天然耐药分离株可能依赖mdrL介导的外排之外的其他生存机制。这一发现与此前研究结论一致：外排泵是敏感株适应BAC的关键，但对天然耐药株并非必需，支持其他耐受机制的存在。另一个与QAC类杀菌剂抗性相关的基因是emrE，该基因突变会导致单核细胞增生李斯特菌对QAC类消毒剂（BAC与E-San）的敏感性升高，但对红霉素、三氯生等其他受试抗菌剂的MIC值无显著影响。Schulz等人近期证实，适应BAC与十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）的单核细胞增生李斯特菌EGD-e菌株，在外排泵相关基因中发生了突变。BAC耐受株的fepR基因突变导致FepA外排泵上调，不仅赋予对BAC的抗性升高，对庆大霉素、CTAB、环丙沙星的抗性也同步增强；而CTAB耐受则与调控SugE1/E2外排泵的sugR基因突变相关。值得注意的是，即使不存在FepA或SugE1/2，单核细胞增生李斯特菌仍可通过代偿性激活替代外排系统实现适应。当两类外排泵均缺失时，编码二酰甘油激酶的lmo1753基因突变可促进膜重塑，提示存在不依赖外排的适应机制。Bechtel等人进一步报道，甲基磺酸乙酯（EMS）诱导的BAC敏感单核细胞增生李斯特菌突变可产生两株BAC耐受突变株，这两株突变株中编码MmpL家族转运蛋白的lmo2463表达上调，与对BAC及氟喹诺酮类药物的抗性升高相关。影响细胞膜组织相关基因（如lmo1753二酰甘油激酶、lmo2768通透酶）的突变也可能提升单核细胞增生李斯特菌在食品加工环境中的存活能力。此外，两株突变株的溶血活性均显著高于亲本菌株。总体而言，多数研究报道的耐受性发展均发生在低于生产商推荐浓度的消毒剂水平下，而这类亚致死浓度在实践中极易出现，例如在地面或排水沟等区域，因清洁不充分或稀释导致。消毒剂暴露引发的氧化胁迫可导致自发突变，进而引起外排泵过表达，进一步促进单核细胞增生李斯特菌在FFPE中的耐受性。据现有认知，尚无研究专门探讨持久性单核细胞增生李斯特菌菌株是否比散发性菌株表现出更强的外排活性，这是理解其持久性机制的重要知识缺口。

冷休克蛋白（CSPs）

冷休克蛋白（CSPs）是一类高度保守的小分子蛋白，通常由65至75个氨基酸组成，分子量约7.4 kDa，但不同单核细胞增生李斯特菌菌株的CSPs大小可能存在差异。该物种拥有3种CSPs：CSP-A、CSP-B与CSP-D，广泛被证实作为低温骤降的防御机制表达。除冷胁迫耐受功能外，CSPs也被报道可影响运动性或溶血活性等毒力相关因子。CSP-A主要与冷胁迫适应相关，CSP-B通常关联毒力，CSP-D则对两种表型均有贡献。在高盐浓度条件下，Duché等人观察到甘氨酸甜菜碱转运蛋白GbuA作为耐盐机制的一部分表达上调，同时伴随另外两种通用胁迫蛋白DnaK与Ctc的上调。研究共鉴定出12种盐诱导蛋白，分属盐休克蛋白组与胁迫驯化蛋白组。单核细胞增生李斯特菌的CspA、CspB与CspD可为渗透胁迫（氯化钠）与低温胁迫提供双重保护，其中CspA在冷耐受中作用更突出，CspD对盐抗性的贡献更显著。Kragh等人评估了CSPs对29株单核细胞增生李斯特菌（21株野生型、8株CSPs突变株）干燥耐受性与生物被膜发育的影响，结果显示CSPs对干燥耐受性（15°C、相对湿度43%）呈负向影响。有趣的是，研究人员观察到运动性降低与干燥耐受性升高存在相关性，且csp-A缺失可能与生物被膜形成能力下降相关。与其他研究结论一致，单核细胞增生李斯特菌EGDe的CSPs突变会导致毒力减弱、细胞聚集能力下降、鞭毛生物合成与运动性受损。在3种CSPs基因中，csp-B对毒力的功能贡献仅次于csp-D，若这些基因发生突变，可能损害单核细胞增生李斯特菌的宿主细胞侵袭能力。使用相同的单核细胞增生李斯特菌野生型与csp（A、B、D）突变株，研究人员评估了对溶血素与单核细胞增生李斯特菌溶素O（LLO）产生这两种毒力因子的影响。研究表明，同时敲除3种基因或仅敲除csp-B，会导致LLO产量显著降低；令人意外的是，仅敲除csp-B时，LLO水平与野生型相比仍相对接近。另一方面，只有双突变（csp-AB与csp-AD）或三突变（csp-ABD）菌株的溶血活性降低，单基因缺失不影响该表型。尽管CSPs似乎在多种与感染能力相关的细胞过程中发挥重要作用，且已被证实是单核细胞增生李斯特菌在冷藏温度下存活的关键，但目前尚无研究将CSPs与持久性直接关联，不过多项研究指出csp-A与csp-D蛋白在高盐与冷藏条件下的重要性。

生物被膜形成（BF）

生物被膜是复杂的多细胞结构，微生物群落包裹于胞外聚合物基质中，可提供对抗外部胁迫的卓越保护。简言之，生物被膜形成通常经历三个阶段：（I）聚集与黏附——细菌彼此聚集或黏附至生物或非生物表面；（II）生长与积累——细胞增殖与群落招募；（III）解聚与脱落——细胞以聚集态或单细胞形式脱离生物被膜。单核细胞增生李斯特菌的生物被膜生成是重要的生存机制，可提升其对抗化学或机械清除的整体抗性，促进其在FFPE中的持久存在。近期研究将单核细胞增生李斯特菌生物被膜形成与高细胞表面疏水性、自聚集能力与胞外多糖合成相关联。与浮游状态相比，强生物被膜形成能力的菌株对Caco-2细胞的黏附与侵袭能力显著更高，且对红霉素、克林霉素、环丙沙星、达托霉素等多种抗生素的敏感性降低。agrA、flgE、fliD与inlA的上调与生物被膜发育相关，而motB的下调则与既往强调运动性在表面黏附中重要性的研究结论形成对比。Liu等人证实，携带clpL、mdrL与lde基因的菌株表现出更强的生物被膜形成能力与亚致死氯浓度（250 mg/L）耐受性。其中一株携带6种生物被膜相关基因（actA、prfA、lmo0673、recO、lmo2504与luxS）的菌株在前4天表现出强生物被膜形成能力，但此后该能力显著下降；而两株耐受株在第4天后生物被膜产量显著上升。值得注意的是，只有这两株耐受株携带与胁迫响应相关的clpL基因，提示clpL可能在长期或胁迫条件下增强或上调生物被膜发育。环境条件也会影响生物被膜形成与细胞黏附：低温（12°C）会降低从冷熏三文鱼工厂分离的19株单核细胞增生李斯特菌的生物被膜形成能力，而30–37°C则有利于生物被膜发育。这些分离株的生物被膜形成能力与内化素基因、胁迫生存岛（SSI）及红霉素抗性的存在呈正相关。菌株来源也会进一步影响生物被膜行为：一项针对意大利2003–2014年57株食品相关菌株的研究显示，所有菌株均可形成生物被膜，但肉类分离株中中到强生物被膜生产者占比（57%）高于乳制品分离株（28%）；SSI-1、arsD与截短InlA蛋白的存在与更高水平的生物被膜产量相关，与其他研究的遗传关联报道一致。尽管持久性菌株的名称暗示其可能比散发性菌株具有更强的生物被膜生成能力，但生物被膜形成与持久性之间的关系仍存在争议。Harvey等人采用短期与长期孵育实验评估138株单核细胞增生李斯特菌的生物被膜形成能力：短期实验中92%的菌株被归类为弱生物被膜形成者，6.5%为中等，1.5%为强生物被膜形成者，持久性与散发性食品相关菌株间趋势相似；延长孵育时间后，许多菌株的生物被膜形成能力显著提升，此长期实验中致病性较弱的血清型1/2c（包括散发与持久性食品分离株）是强生物被膜形成者，而高毒力的血清型4b则不能形成生物被膜。与上述发现相反，另一项针对80株单核细胞增生李斯特菌分离株的生物被膜形成检测未发现血清型与生物被膜形成之间的显著关联，仅散装牛奶样本的持久性菌株表现出更高的生物被膜形成能力；从鸡肉加工厂分离的持久性菌株也倾向于形成更厚的生物被膜，但同样未检测到菌株血清型与生物被膜形成的显著关系。如前所述，迫切需要深入理解单核细胞增生李斯特菌生物被膜的发生规律，同时规范方法学并优化实验设计以更真实反映食品相关环境。菌株差异、方法差异与环境条件差异会导致研究结果不一致，阻碍结果的清晰解读与横向比较。例如，持久性与散发性单核细胞增生李斯特菌菌株的生物被膜形成差异，及其与血清型的可能关联，仍是科学界的争议议题：多项研究报道生物被膜发育增强与持久性存在明确关联，但也有研究未发现该特征是持久性菌株的核心性状。此外，混合种生物被膜（如单核细胞增生李斯特菌与荧光假单胞菌共存）、胁迫条件下的生物被膜形成等因素已被证实会影响单核细胞增生李斯特菌的生物被膜发育。单核细胞增生李斯特菌与其他微生物（如假单胞菌科或植物乳植杆菌）在混合种生物被膜中的互利作用，可增强其对过氧乙酸或BAC等消毒剂的抗性。尽管评估该保护属性时通常不考虑这些因素，但未来对比持久性与非持久性菌株生物被膜形成的研究应将此类方面纳入考量。总体而言，生物被膜无疑是单核细胞增生李斯特菌的重要防御机制，但其作为持久性主要驱动因素的作用仍不明确。

基于基因组学的持久性研究方法

基因组学方法为研究单核细胞增生李斯特菌持久性提供了有前景的补充工具。基因组分析革新了该病原体的研究范式，可通过聚合酶链式反应（PCR）扩增分型、脉冲场凝胶电泳（PFGE）与多位点序列分型（MLST）等多种方法实现精细的分子分型、菌株鉴定与聚类。由于部分分型方法耗时较长，且方法学与数据分析复杂，业界正在开发新方案以大幅降低FFPE中食源性病原体（包括识别单核细胞增生李斯特菌持久性菌株）鉴定的时间与复杂度。为此，qPCR类方法如GENE-UP? TYPER（bioMérieux）可便捷用于菌株分型与聚类，识别工厂内重复分离的显性菌株。在测序类方法中，全基因组测序（WGS）已成为持久性研究的终极工具，可实现持久性与非持久性菌株的高分辨率比较。总体而言，与传统分型方法相比，WGS的分辨力、数据准确性与基因组信息丰富度均大幅提升，增强了其在单核细胞增生李斯特菌病暴发调查与溯源中的应用价值。此外，bioMérieux开发的新型方法提出了一种更快捷可靠的菌株聚类方案，无需特定且耗时的实验，这应是开发FFPE单核细胞增生李斯特菌持久性评估新方法与新设备的核心目标。基因组学方法通常会产生海量复杂数据，需要强大的算力与专业知识将数据转化为实用结果。随着这类方法（如WGS）成本的随时间下降，加之流行病学研究推动，产生的“大数据”量持续增长。结合WGS数据的计算工具在推进持久性研究方面潜力巨大：目前这类工具已应用于食品安全预测微生物学、临床微生物学图像分类，以及DNA与RNA测序产生的大数据分析。该领域的最新进展催生了多项主要面向食品安全、基于机器学习的探索，例如生物被膜发育与检测研究，或针对单核细胞增生李斯特菌、梭菌属、沙门氏菌属等知名食源性病原体的研究。例如Tanui等人成功应用监督式机器学习（ML）将单核细胞增生李斯特菌病病例归因至特定食物来源，证明当输入高分辨率WGS数据时，机器学习可提升溯源能力。Gmeiner等人采用该方法，利用6种ML算法分析单核细胞增生李斯特菌亚种水平的毒力，展示了这类模型评估该病原体毒力与变异的潜力。研究人员使用1649株分离株的WGS数据与QAC最小抑菌浓度（MIC）值开发了ML预测模型，结果显示其在预测耐受性与MIC值方面具有良好潜力，并可挖掘与消毒剂耐受相关的新基因。在此基础上，Gmeiner等人近期开发了名为ListPred的ML工具，专门用于分析单核细胞增生李斯特菌的毒力潜力与消毒剂耐受性。基于WGS的ML序列分析还可用于预测酸、冷、盐与干燥胁迫响应表型，研究人员认为这是食品安全与该病原体风险评估的重要进步。以单核细胞增生李斯特菌为模型，Njage等人证实ML模型可基于WGS数据预测新型或既往未表征菌株的胁迫表型组分，为未来的持久性分析提供宝贵参考。尽管单核细胞增生李斯特菌的计算驱动解决方案已取得可观进展，但多数研究聚焦于菌株毒力与抗性，未能区分持久性与非持久性菌株。研究同时强调，小数据集的使用可能限制模型的准确性与预测性能，是这类工具开发中的显著挑战。尽管如此，将测序数据与生物信息学及ML分析整合，是提升持久性机制理解的重要一步，最终将支持更有效的食品安全管理