基于荧光探针羟基-萘基-甲基苯并噁唑（HNBO）染料及其与荧光二氧化硅纳米颗粒联用作为重金属靶向系统的应用：镉污染环境中的结果与问题排查

《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》：Employment of the fluorescent probe hydroxy-naphthyl-methylbenzoxazole-based dye and its combination with fluorescent silica nanoparticles as potential heavy metal-targeting systems: results and troubleshooting in Cd-polluted environments

　　

为解决生物系统中重金属（HM）污染监测的关键需求，本研究评估了一种基于HNBO的新型荧光探针用于癌细胞系和贻贝血细胞中镉（Cd）检测的性能。游离探针（HNBO-DEN）及其与核壳二氧化硅纳米颗粒（Si-NPs）的偶联物（HNBO-DEN-NPs）均展现出稳健的Cd传感能力，且不影响细胞活力。关键发现包括靶向检测（该荧光探针成功识别生物指示剂中的镉，为传统破坏性分析技术提供了实时替代方案）和双系统效率：游离探针和二氧化硅NP偶联探针均有效，但程度和特点不同——HNBO-DEN更有效地检测细胞质中的Cd浓度，而NP偶联物更适合检测靶器官和储存细胞器中的金属。这两种探针的联合使用可实现污染物（Cd）和检测器（NP）的精确活细胞追踪，最大化诊断、环境和细胞学信息。

随着全球重金属（HM）污染问题日益严峻，重金属的选择性检测已成为化学、生物学、环境科学、农业科学及食品安全等领域的重要研究方向。重金属即使在极低浓度下也具有极高毒性，可对人类健康和环境造成损害。其在生态系统中具有持久性，易以离子形式在水产品和食物中累积，并通过食物链进入人体，构成潜在健康威胁。目前，重金属的测定主要依赖原子吸收光谱法、电感耦合等离子体质谱法、中子活化分析、阳极溶出伏安法、X射线荧光光谱法、离子色谱法、拉曼光谱法、电热原子吸收光谱法、冷原子吸收光谱法及电位离子选择性电极等仪器分析技术。然而，这些方法均无法应用于活体生物或细胞的在体检测，且存在设备昂贵、实验条件苛刻、样品前处理繁琐等局限，无法获取细胞活力及功能相关信息。

荧光小分子探针因其灵敏度高、选择性好、操作简便、响应迅速、无损检测、采样频率高、设备成本低、可直接目视观察、信号检测便捷，以及在复杂基质中痕量金属离子分析方面更具优势，备受关注。近年来，荧光技术在重金属离子检测领域的研究进展主要集中于食品基质分析。针对镉（Cd）的特定荧光传感器有望阐明其致癌机制并监测环境浓度变化，同时可作为评估和动态绘制细胞内金属离子波动的理想工具。

本研究旨在评估一种新型荧光探针HNBO-DEN（N-(2-(2′-羟基-3′-萘基)苯并噁唑-4-基甲基)-N,N-双(2-氨乙基)胺）及其与核壳二氧化硅纳米颗粒（Si-NPs）偶联物（HNBO-DEN-NPs）作为重金属追踪探针的潜力，该研究发表于《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》。研究人员选择HT-29人结肠腺癌细胞系和地中海贻贝（Mytilus galloprovincialis）血细胞作为模型：前者因其常用作污染物研究模型，后者作为海洋环境生物指示剂，其代谢特性促进污染物积累。

本研究主要采用以下关键技术方法：荧光探针HNBO-DEN的合成及其与NFR700二氧化硅纳米颗粒的共价偶联；HT-29细胞培养及CdCl₂暴露处理；地中海贻贝血淋巴采集及体外暴露实验；流式细胞术（FC）分析细胞活力及荧光强度；共聚焦显微镜（CM）成像观察探针分布；动态光散射（DLS）及透射电子显微镜（TEM）表征纳米颗粒形貌与粒径；TNBSA比色法测定偶联反应效率。

**合成与表征**

HNBO-DEN探针基于2-(2-羟基-3-萘基)-4-甲基苯并噁唑（HNBO）荧光团与N,N-双(2-氨乙基)胺受体单元构建，具有激发态分子内质子转移（ESIPT）特性，在水中对Zn²⁺和Cd²⁺有响应。NFR700纳米颗粒掺杂花菁5.5（Cy5.5）染料，吸收/发射峰分别为686 nm和712 nm，平均粒径约9 nm。TEM和DLS分析显示，NFR700粒径分布为5–15 nm，而HNBO-DEN偶联后增大至20–70 nm（平均约35 nm）。吸收光谱证实HNBO-DEN成功共价连接于PEG壳层，其特征吸收峰从325 nm轻微红移，表明局部环境极性低于水。加入Cd²⁺后，425 nm处出现新吸收带，归因于萘酚基团去质子化；发射光谱显示540–548 nm处荧光显著增强，证明偶联配体仍保持螯合能力。透射归一化发射强度计算表明，Cd²⁺的加入提高了HNBO-DEN的发光效率，HNBO-DEN-NFR700可作为合适的Cd²⁺荧光化学传感器。

**HNBO-DEN细胞染色：HT-29肠细胞中镉含量的检测**

研究人员首先评估了HNBO-DEN的细胞毒性，发现50和100 μM浓度具有毒性，但工作浓度（500 nM）安全。通过AmCyan和FITC荧光通道比较，选择FITC通道进行后续分析，因其背景干扰较低。与商品化Leadmium? Green染料相比，HNBO-DEN展现出相当的检测灵敏度。

HT-29细胞暴露于不同浓度CdCl₂（50、100、150 μM）后，45分钟时50和100 μM组出现轻微但显著的荧光增加，150 μM组不显著；24小时后，活细胞中荧光呈剂量依赖性持续累积，而死细胞中信号不一致，归因于膜破裂导致的探针泄漏。HNBO-DEN-NPs在45分钟时仅在150 μM组显示显著荧光增加，24小时后荧光增强与镉剂量成正比，且死细胞中同样检测到显著MFI增加。共聚焦显微镜显示游离探针呈弥散绿色荧光，而NP偶联物呈点状分布，提示其靶向细胞器（线粒体、内质网、溶酶体）中镉蓄积的能力，NFR700固有荧光可确认NP及HNBO-DEN的内化量。

**HNBO-DEN在地中海贻贝血细胞中的应用**

为评估HNBO-DEN检测环境生物指示剂中Cd²⁺的能力，研究人员采用健康贻贝血淋巴细胞进行实验。30分钟暴露后，透明细胞（hyalinocytes）死亡比例与镉浓度相关，但最高浓度下死亡率仅10%；颗粒细胞（granulocytes）仅在高浓度下出现显著死亡（15%）。1 mM CdCl₂处理改变了两种血细胞的相对比例，提示稳态紊乱。1小时后，颗粒细胞死亡率达25%。

HNBO-DEN MFI在两种血细胞中均随Cd²⁺浓度增加而升高，颗粒细胞尤为敏感。共聚焦显微镜确认了荧光强度的浓度依赖性增加，并揭示探针的核周分布（白色箭头）及杯状边缘形态（黄色箭头）。1小时后，颗粒细胞在1 mM组出现最高荧光，但高浓度下最高荧光值未达预期，与细胞死亡率升高相关。形态学观察显示，高浓度镉处理后细胞呈球形、无突起且体积减小，符合透明细胞特征。

**HNBO-DEN-NPs在贻贝血细胞中的镉暴露效应**

HNBO-DEN-NPs在30分钟时仅在1 mM组显示显著荧光增加，且荧光与镉浓度成正比。NP单独对照组荧光不随镉剂量变化，排除"荧光污染"干扰。共聚焦图像显示绿色荧光（HNBO-DEN）和红色荧光（NFR700）的差异化定位，处理组呈点状分布，可能与溶酶体积累有关。1小时后，1 mM组荧光显著增加，显微镜观察到颗粒细胞形态改变（黄色星号）和丝状伪足伸长（黑色箭头），提示应激反应。

**双染色系统联合应用**

研究人员采用系统故障排除策略：界定问题、逐步分析、寻找解决方案、实施应用及效果评估。首先验证HNBO-DEN和HNBO-DEN-NFR700的细胞兼容性及镉检测能力；其次在HT-29细胞和贻贝血细胞中验证，结果显示两种系统均有效，但程度不同。共聚焦显微镜用于确认定量数据并增进信息丰富度，但HNBO-DEN的细胞器趋向性仍需进一步研究。最终，通过整合两种系统的MFI数据，在贻贝血细胞中建立了镉浓度与荧光强度的可见比例关系，证实联合应用可增强镉检测的可靠性。

本研究表明，HNBO-DEN作为一种新型ESIPT基荧光化学传感器，由2-(2-羟基-3-萘基)-4-甲基苯并噁唑荧光团与N,N-双(2-氨乙基)胺受体组成，对镉检测具有高效性。在HT-29人肠细胞中，HNBO-DEN可有效检测镉并呈剂量依赖性荧光增强；在贻贝血细胞中，该探针成功识别了不同浓度梯度的镉污染，颗粒细胞作为更敏感的亚群可用于镉追踪。HNBO-DEN与NFR700纳米颗粒的偶联保留了染料的传感能力，同时提供了关键诊断优势：实现纳米颗粒内化的精确追踪，并区分活细胞与受损细胞中的镉积累。具体而言，HNBO-DEN-NPs系统需精细检测细胞活力，并与辅助信息结合应用。两种制剂均成为Cd²⁺及重金属监测的有力工具，确保分析过程中样品活力的维持。镉通过烟草烟雾和摄入途径进入人体，具有长生物半衰期；而贻贝作为环境监测生物指示剂对追踪人为痕量金属的累积至关重要。该研究为活体细胞中重金属的实时、无损检测提供了新的技术途径。