《Biosensors and Bioelectronics》：Epitope-Level Insights for Immuno-Recognition of JEV NS1 via Gold Nanoflower- MXene Composite
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P.R. Ramya | V.V. Jothiswaran | Rahul Mallick | Prem Prakash Tripathi | Sonu Gandhi
BRIC-国家动物生物技术研究所（NIAB），海得拉巴-500032，特伦甘纳邦，印度
摘要
早期且准确地识
P.R. Ramya | V.V. Jothiswaran | Rahul Mallick | Prem Prakash Tripathi | Sonu Gandhi
BRIC-国家动物生物技术研究所（NIAB），海得拉巴-500032，特伦甘纳邦，印度
摘要
早期且准确地识别日本脑炎病毒（JEV）对于有效控制疫情和监测至关重要。本研究开发了一种电化学免疫传感器，用于检测JEV的非结构蛋白1（NS1）。JEV NS1抗原在体外表达、纯化并重新折叠，以获得可溶且具有功能的蛋白质。通过杂交瘤技术生成了高亲和力的单克隆抗体（mAbs）。为了获得分子层面的见解，使用下一代测序（NGS）解码了抗体基因序列，而分子对接分析则实现了表位-配体相互作用的预测。为了提高灵敏度，对丝印碳电极（SPCEs）进行了金纳米花/MXene（GNF/MXene）纳米复合材料的修饰，从而增强了传感器的电活性表面积和电导率。循环伏安法（CV）、电化学阻抗谱（EIS）和差分脉冲伏安法（DPV）被用来分析电化学反应。该传感器在广泛的JEV NS1浓度范围内（1 fM-1 μM）表现出0.35 fM的最低检测限（LOD）。该免疫传感器进一步用临床样本进行了评估，结果显示其具有高特异性（100%）、高灵敏度（95%）和高准确性（96.66%），且对其他黄病毒NS1抗原无交叉反应，响应时间仅为10分钟，并在4周内保持了优异的稳定性。
引言
多种病原病毒，如登革热病毒（DENV）、基孔肯雅病毒（CHIKV）、尼帕病毒（NiV）、日本脑炎病毒（JEV）、埃博拉病毒、猪流感病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）和流感病毒，都存在重新出现和爆发的周期（Akinsulie和Idris，2024；Boonanek等人，2025；Edward等人，2025；Hussein等人，2024；Nguyen等人，2024；Peacock等人，2024；Sahay等人，2025）。特别是这些RNA病毒，由于其快速的突变率以及逃避免疫反应的能力，监测它们非常具有挑战性（Purushotham等人，2025）。JEV是一种由蚊子（Culex tritaeniorhynchus）传播的黄病毒，是亚太地区日本脑炎（JE）的主要原因。临床上，JE表现为急性脑炎，其特征是高烧、抽搐、颈部僵硬，在严重情况下会导致瘫痪或死亡（Zhu等人，2023）。由于JE在流行地区对脆弱人群的风险增加，因此需要改进诊断工具。用于检测JEV的生物标志物包括病毒RNA、NS1抗原和宿主体内产生的JEV特异性IgM抗体，其中NS1对于早期诊断尤为重要。目前，常规的诊断方法包括病毒分离、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、酶联免疫吸附测定（ELISA）和斑块减少中和试验（Wang和Yue，2025）被广泛用于JEV的检测。由于这些技术耗时、需要专业技能并且依赖于复杂的实验室设施，生物传感器作为简单、快速、准确和即时诊断的工具应运而生（Ramya等人，2025b）。
典型的生物传感器由三个关键部分组成：将生物识别过程转化为可量化信号的换能器、选择性结合目标分析物的生物识别元件以及记录输出信号的检测器（Blázquez和Jiménez de Oya，2025）。生物识别元件在决定生物传感器的特异性和灵敏度方面起着重要作用，抗体、酶和适配体是常用的生物分子。据报道，多克隆抗体和单克隆抗体都可用于生物传感器的开发。多克隆抗体（pAbs）成本效益高且相对容易生产，但存在批次间变异性、交叉反应性和保质期有限的问题。然而，单克隆抗体（mAbs）通过杂交瘤技术生产，为pAb提供了一种均匀且高度特异的替代方案。由于其可重复性、可扩展性和高亲和力，mAbs在病毒诊断的生物传感器开发中越来越受到青睐（Malhotra等人，2024）。
通过整合不同尺寸的纳米材料（包括纳米颗粒、纳米管、纳米线和自组装单层），可以进一步提高生物传感器的灵敏度，这些材料具有高表面积与体积比、生物相容性和优异的导电性（Uniyal等人，2024）。二维（2D）纳米材料（如MXenes）因其亲水性、大表面积、显著的导电性和丰富的表面化学性质而成为有前景的候选材料，这有助于高效的功能化和电子转移（Khan等人，2025；Ramya等人，2025a）。具有各种形态的金纳米颗粒（AuNPs）因其出色的特性（如生物相容性、光学性质和优异的导电性）而特别引人注目。金纳米花（GNFs）是一种AuNPs，具有独特的分支形态、更高的活性位点密度以及比球形AuNPs更好的催化和传感性能（Trang等人，2024）。金纳米花与MXene（GNF/MXene）的结合结合了MXene的高导电性和GNF的光学及表面增强特性（Diouf和Savane，2025）。
在本研究中，我们旨在使用高亲和力mAbs和GNF/MXene纳米复合材料开发一种电化学免疫传感器，以特异性和灵敏度检测JEV NS1蛋白。纯化的JEV NS1蛋白被用于免疫以产生高亲和力单克隆抗体，这些抗体经过广泛的表征以验证其纯度和结合能力。生成的高亲和力mAb经过纯化和表征后用作生物识别元件。为了深入理解分子识别机制和表位-配体相互作用，从克隆中分离出mRNA并进行了计算机模拟（in silico）研究。为了获得更好的电导率和表面功能性的有效转换材料，对GNF/MXene复合材料进行了表征以制造传感器。开发的传感器在临床样本上进行了测试，证明了其在准确、快速和早期检测JEV感染方面的分析性能。
章节片段
设计的GNF/MXene纳米复合材料：合成和高级物理化学表征
通过柠檬酸还原HAuCl4成功合成了金纳米种子（GNS），得到了稳定且大小均匀的球形纳米颗粒，这些颗粒作为各向异性生长的成核中心。动态光散射（DLS）分析显示平均水动力直径为29.9 nm，多分散指数（PDI）为29.3%，表明GNS是单分散的，平均ζ电位为-32.5 mV，证实了由于柠檬酸包覆作用而具有胶体稳定性。
结论
开发了一种高灵敏度和可靠的电化学免疫传感器，用于检测JEV NS1抗原，该传感器使用了内部生成的mAb。鉴于公共数据库中缺乏针对JEV NS1的抗体序列，通过分离mRNA并合成cDNA对mAb的可变区域进行了测序。基于此计算机模拟（in silico）对接分析揭示了mAb与JEV NS1预测表位的优先相互作用。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。
CRediT作者贡献声明
P R Ramya：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、可视化、验证、方法学、研究、数据管理。V V Jothiswaran：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、可视化、方法学。Prem Prakash Tripathi：资源、方法学。Rahul Mallick：方法学。Sonu Gandhi：撰写 – 审稿与编辑、软件、资源、项目管理、资金获取、概念化。
利益冲突声明
? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
Sonu Gandhi感谢国家动物生物技术研究所（NIAB）提供的核心资助（C0038）。Ramya P R感谢生物技术部（DBT）和法里达巴德区域生物技术中心（RCB）提供的DBT奖学金（DBT/2022-23/NIAB/2051），用于博士学位注册。
