基于CRISPR/Cas12a介导的双模集成报告基因FU的无放大双模传感器的构建，用于超灵敏检测非核酸目标脱氧雪腐镰刀菌烯醇

《Biosensors and Bioelectronics》：Construction of an Amplification-Free Dual-Mode Sensor Based on CRISPR/Cas12a-Mediated and Dual-Mode Integrated Reporter FU for Ultrasensitive Detection of Non-Nucleic Acid Target Deoxynivalenol

　　

任凯云|于春雷|吴龙飞|马金苗|徐学珍|贾丽娜|杨青青

山东工业大学农业工程与食品科学学院，中国淄博市新村镇西路266号，255049

摘要：

对脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）的敏感和准确检测对公共卫生至关重要。CRISPR/Cas12a系统在生物传感方面表现出高特异性和效率，但在非核酸检测方面仍存在挑战，例如需要多个报告基因来实现双模式信号输出，以及在没有扩增的情况下检测灵敏度较低。在这项研究中，利用Fe₃O₄/Au/PDA的磁性和荧光淬灭特性以及UiO-66-NH₂的荧光/催化能力，我们开发了一种多模式集成报告基因（FU），即Fe₃O₄/Au/PDA-ssDNA-UiO-66-NH₂，通过单一报告基因实现双模式信号输出。在DON存在的情况下，DON-Ab-aDNA复合物激活CRISPR/Cas12a，后者会无差别地切割FU中的单链DNA，释放出自由的UiO-66-NH₂。因此，UiO-66-NH₂的荧光信号得以恢复，同时它催化TMB产生蓝色反应。基于CRISPR/Cas12a的荧光-比色双模式生物传感器（CrisprFU）对DON的比色检测限（LOD）为2.15 × 10^-3 ng/mL（检测范围：2-100 ng/mL），荧光检测限为7.96 × 10^-4 ng/mL（检测范围：0.5-40 ng/mL）。在实际样品中的成功应用表明，荧光检测的平均回收率为97.04%-104.4%，比色检测的平均回收率为96.4%-101.8%，证实了其实际应用潜力。此外，通过更换识别抗体，CrisprFU系统可以扩展到检测其他分析物。

引言

霉菌毒素是有毒的次级代谢产物。根据联合国粮食及农业组织（FAO）的数据，每年约有四分之一的世界农产品受到霉菌毒素的污染，导致大量食物损失（Nji和Mwanza 2024；Phan等人2024）。其中，脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）是一种B型三萜类霉菌毒素，在饲料和农产品中的检出率很高。由于其免疫毒性、生殖和致畸作用、基因毒性、神经内分泌干扰以及肠道毒性，它对人类和动物健康构成重大威胁（Murtaza等人2024）。摄入DON可能导致呕吐、生长迟缓和胃肠炎等症状（Pestka和Smolinski 2005）。因此，建立有效的DON检测方法对于保护公共和动物健康至关重要。传统的基于仪器的分析方法，如高效液相色谱（HPLC）（Zhu等人2021）和薄层色谱（Qin等人2021），可以提供准确可靠的DON检测结果，但存在样品预处理复杂、设备昂贵且体积庞大以及需要经验丰富的技术人员的缺点。为了创新检测方法，出现了具有多种信号输出的生物传感器，包括表面增强拉曼散射（SERS）（Han等人2025）、电化学（Xia等人2023）和荧光（Meng等人2025）传感器。

CRISPR/Cas系统由规律间隔的短回文重复序列（CRISPR）和CRISPR相关酶（Cas）组成，在基因编辑方面显示出显著优势（Jinek等人2012；Tabebordbar等人2016）。由于其卓越的目标基因识别能力，它成为有效的信号放大工具。除了基因编辑之外，CRISPR/Cas逐渐应用于医学核酸诊断和其他检测领域（Amitai和Sorek 2016）。在核酸检测中，CRISPR-Cas生物传感器在增强信号转导和放大方面显示出巨大潜力（Li等人2023a；Yin等人2024）。为了扩展CRISPR-Cas传感器的应用范围，研究人员越来越多地关注非核酸（NNA）目标，包括环境污染物、疾病预后生物标志物（如抗生素、毒素、蛋白质甚至细胞）（Selvam等人2022；Zhao等人2023）。一个关键挑战是将非核酸目标的识别事件转化为CRISPR/Cas12a系统的切割活性，实现小分子信号与DNA信号之间的转换（Cheng等人2022；Zhou等人2023）。最近的研究将适配体和抗体引入CRISPR/Cas12a系统以检测非核酸目标（Niu等人2021；Paialunga等人2025；Xiong等人2019），这引起了我们的注意。单克隆抗体对目标物质具有出色的特异性和亲和力，在检测应用中非常成熟，是免疫测定方法中不可或缺的关键组成部分。因此，将单克隆抗体作为探针结合到CRISPR/Cas12a系统中，可以更好地促进小分子信号与DNA信号之间的转换，推动CRISPR/Cas12a在非核酸目标检测中的应用。

CRISPR/Cas系统在霉菌毒素检测中的当前应用包括荧光、比色、拉曼（Zhang等人2023）、电化学生物传感器和侧向流动分析（LFA）（Liu等人2024；Selvam等人2022）。这些方法通常采用单信号输出，并通常与各种目标信号放大策略结合使用，如聚合酶链反应（PCR）（Niu等人2025）、重组酶聚合酶放大（RPA）（Casati等人2022）和杂交链反应（HCR）。虽然目标信号放大提高了检测灵敏度，但也增加了检测时间和假阳性的风险。另一方面，多模式检测技术可以通过最小化系统误差和消除外部干扰显著减少假阳性和假阴性（Li等人2025b）。将多种信号整合到CRISPR/Cas检测系统中为提高检测性能提供了巨大潜力。然而，目前的基于CRISPR/Cas12a的双模式检测大多依赖于同时使用多个报告基因或与免疫层析条结合（Hu等人2025；Li等人2025a；Yang等人2026）。迫切需要开发能够实现多模式同时输出并提高无扩增非核酸检测灵敏度的报告基因。

金属有机框架（MOFs）是由含有氧或氮的有机配体桥接的金属离子网络，其中金属或金属簇作为顶点，刚性或半刚性配体作为连接剂（Liang等人2020）。MOFs具有高度暴露的表面、丰富的活性位点和结构多样性，使其成为比色传感的关键组成部分（包括MMPF-6（Ai等人2013）、MIL-53(Fe)（Chen等人2012）和MIL-101(Fe)（Ma等人2019））。与其他MOFs（如ZIF-8）相比，基于锆的MOF UiO-66-NH₂表现出优异的稳定性，包括耐酸碱性和耐高温性，适用于复杂的生物样品环境（Istirokhatun等人2025）。此外，UiO-66-NH₂同时具有催化活性和高荧光特性，使其成为构建多模式检测策略的理想材料。Fe₃O₄表现出优异的磁响应性，广泛用于在外加磁场中分离和富集目标物质（Shen等人2024）；然而，Fe₃O₄纳米颗粒在水溶液中不稳定，容易聚集和氧化（Madrakian等人2016）。用金纳米颗粒（AuNPs）功能化Fe₃O₄不仅可以减少Fe₃O₄的过度聚集和氧化，还可以增强其在紫外-可见光范围内的宽带吸收能力并提高其荧光淬灭能力（Wu等人2025）。此外，AuNPs可以容易地与DNA、适配体和抗体结合，使其成为识别元素的优秀载体（Azimi等人2026）。进一步用PDA壳修饰可以增强Fe₃O₄/Au/PDA纳米结构的胶体稳定性、单分散性和生物相容性。

在这项研究中，我们将抗体与aDNA结合，以实现小分子信号向DNA信号的转换。我们提出了一种双模式检测报告基因，利用Fe₃O₄/Au/PDA的宽吸收峰通过单链DNA连接来淬灭UiO-66-NH₂的荧光。在DON存在的情况下，DON与抗体-aDNA（CRISPR-Cas12a激活剂DNA）复合物结合并转移到CRISPR反应系统中，从而激活Cas12a蛋白，后者切割Fe₃O₄/Au/PDA-ssDNA-UiO-66-NH₂报告基因分子（FU）中的单链DNA连接，导致UiO-66-NH₂的荧光恢复。此外，UiO-66-NH₂的过氧化物酶样活性催化TMB变为蓝色，实现比色信号输出。值得注意的是，抗原-抗体相互作用、CRISPR-Cas12a转切割系统和新型FU报告基因（CrisprFU检测系统）的协同应用不仅提高了DON识别的特异性，还实现了高效的信号放大和有效的信号输出。开发的CrisprFU检测系统表现出令人满意的传感性能，包括低检测限（LOD）、良好的特异性和稳定性。这项工作进一步扩展了CRISPR-Cas12a系统在非核酸领域的应用，有助于设计双模式集成报告基因并提高无扩增非核酸目标的检测灵敏度。

章节片段

材料和仪器

有关具体的实验材料和仪器，请参阅补充信息中的2.1材料和仪器部分和2.2 Fe的合成部分。

Fe₃O₄/Au/PDA和UiO-66-NH₂/SA的合成

有关Fe₃O₄/Au/PDA和UiO-66-NH₂/SA的具体实验步骤，请参阅补充信息中的2.3部分。

Fe₃O₄/Au/PDA/UiO-66-NH₂报告基因的合成

将0.5 mg的Fe₃O₄/Au/PDA悬浮液通过磁分离去除水溶液，然后重新悬浮在1 mL的0.05 M Tris缓冲液（pH 8.5）中。然后，加入10 μL的20 μM ssDNA（预先处理过）

传感器工作原理

如图1A所示，CrisprFU系统主要由四个基本组件组成：MB-DON-BSA用于与目标分析物竞争性结合，Ab-aDNA参与竞争性反应并激活Cas12a/crRNA转切割活性，Cas12a/crRNA复合物具有转切割活性，以及FU报告基因用于最终信号输出。最初，MB-DON-BSA、不同浓度的DON标准品和Ab-aDNA进行竞争性反应。经过磁分离后，

结论

总之，通过将CRISPR/Cas12a系统与抗体技术结合，本研究展示了一种利用新型多模式集成报告基因FU的DON双模式检测平台。（1）在非核酸领域实现了CRISPR/Cas系统从多报告基因双模式到单报告基因双模式的飞跃：通过使用FU报告基因克服了对多个报告基因的依赖。（2）扩展了非核酸领域的应用：

CRediT作者贡献声明

杨青青：资源、项目管理、资金获取、概念化。贾丽娜：验证。徐学珍：正式分析。马金苗：调查。吴龙飞：方法学、数据管理。于春雷：方法学、数据管理。任凯云：写作——审稿与编辑、写作——初稿、可视化、数据管理、概念化

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢：

本工作得到了山东省自然科学基金（ZR2025MS367）的支持。