《Cell Biomaterials》：Advanced engineering strategies of extracellular vesicles for enhanced central nervous system regeneration and disease modulation
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中枢神经系统（CNS）在损伤或疾病后的有限再生能力要求开发新的治疗策略以促进内源性修复。细胞外囊泡（EVs）已成为一种有前景的无细胞治疗方式，其天然封装了负责组织修复的生物活性旁分泌因子。实现EVs的最佳治疗结果需要合理的工程化以改善其递送、靶向和效力。在此，
中枢神经系统（CNS）在损伤或疾病后的有限再生能力要求开发新的治疗策略以促进内源性修复。细胞外囊泡（EVs）已成为一种有前景的无细胞治疗方式，其天然封装了负责组织修复的生物活性旁分泌因子。实现EVs的最佳治疗结果需要合理的工程化以改善其递送、靶向和效力。在此，研究人员对EV工程化的最新进展进行了全面概述。为了提高其绕过生物屏障的能力并增强治疗效果，使用了关键策略，如表面配体功能化、治疗性药物装载和细胞预处理。然后，研究人员探讨了这些工程化EVs在治疗主要CNS病理中的应用，包括创伤性脑损伤和脊髓损伤（TBIs和SCIs）、胶质瘤、中风以及神经退行性疾病如阿尔茨海默病（AD）和帕金森病（PD）。最后，研究人员讨论了加速工程化EVs作为下一代CNS疾病治疗药物临床转化的当前挑战。
**EVs**：细胞外囊泡（EVs）是细胞释放的膜结合脂质双层囊泡，其膜富含胆固醇、鞘磷脂和神经酰胺，携带蛋白质、核酸和小分子。EVs主要分为外泌体（EV）、微囊泡和凋亡小体（ABs），其中外泌体因组成稳定且分离方法成熟而最受关注。EV生物发生涉及内体分选复合物需要运输（ESCRT）机制，包括ESCRT-0、-I、-II、-III复合物及VPS4-VTA1适配器，负责膜内陷和囊泡形成。此外，还存在ESCRT非依赖途径，如神经酰胺途径和Ras相关蛋白31（RAB31）-flotillin（FLOT）复合物，通过脂质微域驱动囊泡出芽。这些途径共同决定EV的货物构成和分泌。
**EV engineering for targeting the CNS and achieving cell-selective delivery**：为增强EV对中枢神经系统（CNS）的靶向性，需进行表面功能化。常用策略包括将靶向配体（如狂犬病毒糖蛋白（RVG）肽和OX26抗体）通过共价或非共价偶联至EV表面。RVG肽结合烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR），OX26抗体靶向转铁蛋白受体，二者均能促进受体介导的跨血脑屏障（BBB）转运。其他配体如脊髓归巢肽（SP1、SP2等）和自主神经系统至CNS摄取配体（TACL）可增强对脊髓细胞的选择性递送。此外，生物材料如水凝胶可用于局部持续释放EV，减少全身清除并提高疗效。
**Methods for EV engineering**：EV工程化方法分为内源性方法和外源性方法。内源性方法通过调控亲代细胞（如用小分子、低氧、基因修饰等）改变EV货物；外源性方法则对分离后的EV进行修饰。
**Exogenous engineering**：外源性工程化包括电穿孔、被动孵育、冻融循环、皂苷辅助超声处理、挤出和pH梯度驱动装载等方法。脂溶性小分子如苔藓抑素-1和槲皮素可通过简单孵育或超声处理有效装载。亲水性小分子装载效率较低，需优化。治疗性货物还可通过与脂质纳米颗粒或脂质体融合装载，或通过修饰胆固醇等增加脂溶性。小干扰RNA（siRNA）可通过脂质体融合或无机纳米材料辅助装载。然而，外源性方法可能破坏EV膜完整性，如电穿孔导致尺寸不可逆增大，而超声处理影响较小。
**Endogenous engineering**：内源性工程化通过预处理或基因修饰亲代细胞实现。低氧预处理可上调神经保护蛋白和促血管生成因子；小分子如二甲双胍和姜黄素可诱导转录组变化；机械刺激（如剪切力）通过Yes相关蛋白（YAP）信号通路促进EV释放并增强轴突生长。基因修饰常用慢病毒载体过表达特定微小RNA（miRNA）或神经营养因子，如miR-124-3p和脑源性神经营养因子（BDNF）。此外，低氧模拟物（如甲磺酸去铁胺（DFO））可稳定缺氧诱导因子-1α（HIF-1α），调节EV货物。内源性方法对膜完整性影响较小，但需标准化以降低批次差异。
**TBI**：在创伤性脑损伤（TBI）治疗中，工程化EV通过内源性装载miRNA（如miR-124-3p、miR-17-92）或长链非编码RNA（NKILA）抑制神经炎症和氧化应激。低氧预处理或低温应激诱导的EV通过激活PTEN/PI3K/AKT通路促进树突分支。外源性装载抗tau抗体或siRNA（如miR-328a-3p）亦有效。表面功能化（如RVG29肽）增强BBB穿透和脑定位。3D打印胶原/壳聚糖水凝胶和透明质酸水凝胶实现持续EV释放，减少胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达，增加神经元核抗原（NeuN）表达。
**SCI**：脊髓损伤（SCI）中，低氧预处理或褪黑素预处理增强EV的神经保护和抗炎作用。慢病毒转导MSCs过表达CD73、miR-146a-5p或Sonic Hedgehog，产生抗炎和再生性EV。生物材料如水凝胶、电纺纳米纤维和3D支架实现局部持续递送。例如，聚-L-赖氨酸水凝胶同时释放氨基胍和EV，减少瘢痕形成。药物装载（如地塞米松、姜黄素）与靶向配体（如RGD肽、CAQK肽）结合，提高损伤部位积累并促进轴突再生。
**Glioma**：在胶质母细胞瘤（GBM）治疗中，工程化EV通过跨BBB递送增强疗效。脑内皮细胞来源的EV装载线粒体靶向光敏剂用于光动力疗法；环状精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）肽功能化EV靶向GBM细胞。杂交EV-脂质体平台用于近红外二区（NIR-II）成像和光热治疗。RNA治疗包括递送siRNA（抗STAT3、抗Galectin-9）和CRISPR-Cas9进行基因编辑，克服替莫唑胺（TMZ）耐药性。化学药物如阿霉素装载入EV可减少全身毒性并激活免疫原性化疗。此外，工程化EV可重编程免疫抑制肿瘤微环境（TME），如携带TRAIL的诱导神经干细胞（iNSC）来源EV。
**Stroke**：缺血性中风治疗中，MSC来源的EV通过装载BDNF激活BDNF/TrkB通路，减少梗死体积和突触丢失。小胶质细胞来源的EV富含miR-124，通过AK1/Notch1通路促进神经干细胞（NSC）分化和增殖。表面功能化（如RVG29-点击化学）和RGD-4C融合蛋白增强神经元靶向。水凝胶负载NSC-EV改善释放动力学和运动恢复。凋亡小体（ABs）作为可扩展平台装载α-倒捻子素，经基质金属蛋白酶（MMP）激活肽功能化，发挥抗炎和神经保护作用。内皮细胞来源的EV富集miR-27a促进轴突重组。
**AD**：阿尔茨海默病（AD）中，MSC-EV通过携带脑啡肽酶降解Aβ，减少氧化应激和突触损失。低氧预处理MSC-EV富集miR-21，抑制STAT3/NF-κB驱动的神经炎症。NSC-EV恢复线粒体功能并增加Sirtuin 1（SIRT1）表达，改善突触完整性，但不显著改变Aβ斑块。iNSC-EV减少Aβ沉积和p-Tau传播。工程化巨噬细胞EV装载姜黄素和亚甲蓝，抑制tau过度磷酸化和凋亡。EV来源的多样性（MSCs、NSCs、iPSCs）和预处理策略（低氧、药物装载）是提升疗效的关键。
**PD**：帕金森病（PD）中，MSC-EV通过抑制小胶质细胞活化和氧化应激改善运动功能；低氧或生长因子预处理增强神经保护miRNA的水平。NSC-EV递送抗氧化酶（如过氧化氢酶），保护多巴胺能神经元，并包含神经源性miRNA（miR-182、miR-183等）。工程化MSC-EV装载姜黄素（PR-EXO/PP@Cur）经鼻内给药减轻运动障碍。血小板来源的EV经鼻内给药保护多巴胺能神经元。BDNF装载的EV增强多巴胺能神经保护和行为恢复。
**Discussion and conclusions**：EV工程化在CNS疾病治疗中取得显著进展，但仍面临挑战：①生产平台需从2D培养转向3D生物反应器等先进系统，以提升产量和效力；②需通过多组学（转录组、蛋白质组、代谢组）全面表征EV组成，确保质量控制；③外源性装载方法需避免膜损伤，皂苷辅助处理优于电穿孔或超声；④实现持续靶向递送需开发生物材料（如壳聚糖/胶原水凝胶）和表面修饰策略；⑤规模化制造（如切向流过滤（TFF）和色谱法）及基因编辑（CRISPR）用于内源性工程化仍需优化。克服这些限制将推动EV基础治疗药物的临床转化。
