纳米塑料与苯并[a]芘共污染通过内质网应激触发的IRE1α液-液相分离加重肺铁死亡

《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Nanoplastics and Benzo[a]pyrene Co-pollution aggravates pulmonary ferroptosis via endoplasmic reticulum stress-triggered IRE1α liquid-liquid phase separation

　　

摘要：纳米塑料(Nanoplastics, NPs)与多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs)因强疏水相互作用常以复合污染物形式共存于大气环境中。尽管广泛存在，NP–PAH复合物吸入毒性的分子机制仍不清楚。研究人员考察了环境相关浓度下聚对苯二甲酸乙二醇酯(Polyethylene Terephthalate, PET) NPs与苯并[a]芘(Benzo[a]pyrene, BaP)对肺的协同毒性效应。结果表明NPs作为载体促进BaP的细胞摄取与蓄积，通过协同作用加重肺损伤。机制分析显示NPs促使BaP转运至内质网(Endoplasmic Reticulum, ER)，加剧ER腔内未折叠蛋白反应(Unfolded Protein Response, UPR)并恶化ER功能障碍。ER应激诱导肌醇需求酶1α(Inositol-Requiring Enzyme 1α, IRE1α)通过液-液相分离(Liquid-Liquid Phase Separation, LLPS)形成凝聚体，该过程因BaP与IRE1α直接结合而显著增强。BaP与IRE1α共凝聚显著提高IRE1α对X盒结合蛋白1(X-Box Binding Protein 1, XBP1)剪接的活性，激活E3泛素连接酶突触核蛋白1(Synoviolin, SYVN1)的转录上调。进一步证据表明SYVN1介导的核因子E2相关因子2(Nuclear Factor Erythroid 2-Related Factor 2, Nrf2)泛素化降解抑制其细胞保护功能，从而增加细胞对铁死亡的敏感性。综上，本研究揭示了BaP与NPs复合毒性机制，阐明复合污染物通过ER应激触发铁死亡致肺损伤的分子通路。

论文解读：纳米塑料与苯并[a]芘共污染通过内质网应激触发的IRE1α液-液相相分离加重肺铁死亡

研究背景与意义

微/纳米塑料(Micro/Nanoplastics, MPs/NPs)污染已成为全球性环境问题，大气传输是其主要扩散途径，空气中MPs/NPs具有呼吸道生物可利用性并可在人支气管肺泡灌洗液及肺活检组织中检出。NPs因纳米尺度、高比表面积及强吸附能力可富集共存的环境污染物如多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons, PAHs)，其中苯并[a]芘(Benzo[a]pyrene, BaP)是USEPA列出的16种优先控制PAHs中毒性最强者。NPs可作为"特洛伊木马(Trojan horse)"载体改变BaP生物可利用性与毒性，但NP–BaP混合体系复杂，浓度、粒径及受试对象均影响联合毒性，二者共暴露吸入致肺损伤的机制尚不明晰。既往研究提示BaP及NPs可诱导氧化应激、脂质紊乱及基因毒性，内质网(Endoplasmic Reticulum, ER)作为蛋白折叠与脂质代谢中枢易受环境毒物干扰，ER应激可通过未折叠蛋白反应(Unfolded Protein Response, UPR)调控铁死亡，但ER应激–铁死亡串扰在BaP–NP共暴露致肺损伤中的作用未获阐释。本研究以环境常见聚对苯二甲酸乙二醇酯(Polyethylene Terephthalate, PET) NPs与BaP为对象，探讨二者肺部交互作用及协同毒性机制，发表于Ecotoxicology and Environmental Safety。

主要关键技术方法

研究人员制备平均粒径约108.6 nm的PET NPs并验证BaP在NP表面的吸附；采用人支气管上皮BEAS-2B细胞及C57BL/6小鼠（雄性，8周）吸入暴露（0.5 mg/m3 PET NPs + 5 μg/m3 BaP，4 h/d，14 d）构建体内外模型；通过CCK-8检测细胞活力，激光共聚焦观察PET–BaP胞内转运与细胞器共定位；利用小鼠肺组织LC–MS/MS蛋白质组学及ER相关基因PCR阵列分析差异表达蛋白(Differentially Expressed Proteins, DEPs)与基因；Western blot及免疫荧光检测UPR三条经典通路（IRE1α/BiP/XBP1s、PERK/eIF2α/ATF4、ATF6/CHOP）、SYVN1、Nrf2、HO-1、GPX4、FTH1蛋白表达；荧光漂白恢复(Fluorescence Recovery After Photobleaching, FRAP)实验验证IRE1α液-液相分离(Liquid-Liquid Phase Separation, LLPS)液滴性质；表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance, SPR)与分子对接分析BaP–IRE1α互作；Co-IP检测IRE1α–XBP1s及SYVN1–Nrf2结合，泛素化实验验证Nrf2泛素化降解；透射电镜(Transmission Electron Microscopy, TEM)观察线粒体皱缩等铁死亡特征；检测Fe2?（Phen Green SK）、脂质活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)（C11-BODIPY 581/591）、GSH-Px、SOD、MDA评价铁死亡；使用ER应激抑制剂牛熊去氧胆酸(Tauroursodeoxycholic Acid, TUDCA)、铁死亡抑制剂Ferrostatin-1、LLPS抑制剂1,6-己二醇及siRNA敲低XBP1/SYVN1/IRE1α/Nrf2进行干预验证；小鼠肺行H&E染色、肺功能检测及支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar Lavage Fluid, BALF)炎症细胞与细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)分析。

研究结果

2.1. Adsorption of BaP onto PET NPs（PET NPs对BaP的吸附）

SEM显示PET NPs呈不规则形貌、平均直径108.6 nm，BaP吸附后表面出现膜状结构，Zeta电位由?25.5 mV升至?16.9 mV，证实BaP吸附于PET NP表面形成PET–BaP复合物。

2.2. PET NPs altered the intracellular behavior of BaP（PET NPs改变BaP的细胞内行为）

CCK-8显示BaP呈浓度依赖性细胞毒性，PET NPs单独（≤50 μg/mL）无显著毒性，共暴露产生明显协同细胞毒。"特洛伊木马"效应获证实：PET NPs对BaP吸附率达67%，实时荧光成像示PET–BaP入胞更快且荧光更强；10 min–3 h二者共定位，6–12 h BaP蓝荧光与PET红荧光分离，提示胞内解吸附；6 h时BaP主要定位于ER，PET NPs主要富集于线粒体，表明解离后BaP优先转位至ER。

2.3. PET NPs enhanced BaP–induced ER stress（PET NPs增强BaP诱导的ER应激）

小鼠肺蛋白质组学鉴定出153个DEPs且主要定位于ER，其中8个与UPR及ER稳态相关；PCR阵列显示共暴露上调14个ER相关基因（含SYVN1、TRIB3、UHRF1）。Western blot与免疫荧光证实共暴露比BaP单独更显著激活IRE1α/BiP/XBP1s、PERK/eIF2α/ATF4及ATF6/CHOP三条UPR分支，ER应激抑制剂TUDCA可取消该激活，说明PET NPs促进BaP入胞并累积于ER腔，加重未折叠蛋白负荷致UPR过度激活。

2.4. PET NPs enhanced ER stress–triggered ferroptosis induced by BaP（PET NPs增强BaP经ER应激触发的铁死亡）

TEM观察到BaP及PET–BaP处理组线粒体皱缩、膜密度增高及ER肿胀；共暴露组Fe2?（PGSK淬灭）、脂质ROS（C11-BODIPY氧化）最高，GPX4及FTH1下调最显著，GSH-Px与SOD活性最低、MDA最高。Ferrostatin-1预处理逆转细胞毒性、恢复GPX4/FTH1、降低Fe2?与脂质ROS、恢复抗氧化酶活性并降MDA；TUDCA同样减轻铁过载、脂质过氧化及抗氧化失衡并恢复GPX4/FTH1，证实PET NPs通过ER应激驱动铁死亡协同加剧BaP毒性。

2.5. IRE1α liquid–liquid phase separation (LLPS) drives ER stress–mediated ferroptosis following PET–BaP co-exposure（PET–BaP共暴露后IRE1α LLPS驱动ER应激介导的铁死亡）

PCR阵列及WB证实共暴露协同激活XBP1剪接及SYVN1上调；siXBP1或siSYVN1下调SYVN1、恢复GPX4/FTH1、改善氧化还原平衡并减弱铁死亡。免疫荧光见ER应激下IRE1α由弥散变为颗粒状凝聚体，共暴露凝聚体数增多；FRAP显示PET–BaP组EGFP–IRE1α凝聚体恢复更快（148 s恢复73% vs BaP单独44%），具液滴特性，TUDCA抑制凝聚体形成及流动性。SPR与分子对接证实BaP与IRE1α直接结合（π–阳离子、π–H作用涉及Lys599、Leu695等残基），促进IRE1α LLPS。Co-IP示共暴露增加IRE1α–XBP1s复合物；siIRE1α降XBP1s、升GPX4，过表达IRE1α增XBP1s、降GPX4；siIRE1α还恢复抗氧化酶活、减Fe2?与脂质ROS，表明IRE1α LLPS经增强XBP1剪接激活SYVN1促铁死亡。

2.6. Nrf2–HO-1 signaling regulates ferroptosis induced by the PET–BaP complex（Nrf2–HO-1信号轴调控PET–BaP复合物诱导的铁死亡）

WB与免疫荧光示BaP及共暴露降Nrf2蛋白水平（共暴露更强），SYVN1与Nrf2共定位增加、核Nrf2减少；Co-IP证实SYVN1结合Nrf2，泛素化实验显示共暴露协同增强SYVN1介导Nrf2多聚泛素化降解。下游Nrf2靶基因血红素加氧酶-1(Heme Oxygenase-1, HO-1)表达被抑制，siXBP1或siSYVN1部分恢复Nrf2与HO-1；HO-1抑制剂ZnPP加重GPX4/FTH1下调、Fe2?累积、脂质ROS升高及抗氧化失衡。1,6-己二醇（LLPS抑制剂）减弱SYVN1–Nrf2结合、降Nrf2泛素化并部分恢复Nrf2与HO-1，证明IRE1α LLPS上游激活SYVN1–Nrf2降解轴，抑制Nrf2–HO-1抗氧化防御促铁死亡。

2.7. PET–BaP complex induced pulmonary toxicity in mice via ER stress–triggered ferroptosis（PET–BaP复合物经ER应激触发铁死亡致小鼠肺毒性）

体内小鼠吸入暴露：对照组及PET NPs单独组肺泡结构基本完整，BaP及PET–BaP组见肺泡破坏、炎细胞浸润，共暴露组间质炎症更重；肺功能示共暴露组用力肺活量(Forced Vital Capacity, FVC)降幅最大；BALF中性粒细胞、巨噬细胞计数及TNF-α、IL-1β、IL-6升高，共暴露协同增加。肺组织WB共暴露较BaP单独更显著上调UPR蛋白，TUDCA抑制此激活并减轻肺水肿、炎症浸润及细胞因子升高、改善肺功能。共暴露激活XBP1s–SYVN1、降Nrf2/HO-1/GPX4/FTH1、降GSH-Px与SOD、升MDA与Fe2?；Ferrostatin-1或TUDCA干预逆转上述铁死亡指标、减轻炎症与肺功能损害，证实体内PET–BaP经ER应激–XBP1–SYVN1–Nrf2轴驱动肺铁死亡致损伤。

讨论与结论总结

讨论指出本研究深化"特洛伊木马"假说——PET NPs不仅载BaP入胞，且使BaP靶向最脆弱细胞器ER，BaP经细胞色素P450代谢依赖ER故优先定位ER，NPs增强胞内BaP蓄积放大ER应激。持续ER应激转向病理进程触发铁死亡，本研究明确IRE1α LLPS是关键物理化学事件：ER应激驱动IRE1α LLPS，BaP直接与IRE1α互作增强LLPS及XBP1剪接活性，过激活IRE1α–XBP1通路转录上调SYVN1；SYVN1（Keap1非依赖途径E3连接酶）介导Nrf2多聚泛素化降解，削弱Nrf2–HO-1抗氧化防御致铁过载与脂质过氧化，形成ER应激与氧化损伤的恶性循环。

结论（翻译）：本研究探明PET NPs吸附并富集BaP促进细胞摄取与蓄积产生协同损伤；PET NPs增加BaP在ER内共定位致未折叠蛋白堆积与ER功能障碍；BaP与IRE1α互作促进IRE1α LLPS增强其对XBP1剪接活性，转录上调SYVN1；SYVN1介导Nrf2泛素化降解抑制其抗铁死亡保护作用。这些发现界定了PET–BaP共暴露经ER应激驱动铁死亡致肺损伤的机制通路，为NPs加剧PAH肺毒性提供新认识，并指出潜在干预分子靶点。