在全基因组范围内鉴定CCCH型锌指基因家族，并对PbrC3H45在梨树木质素生物合成中的功能进行表征

《Gene》：Genome-wide identification of the CCCH-type zinc finger gene family and functional characterization of PbrC3H45 in lignin biosynthesis of pear

　　

钟潘|魏伟|苏先伟|陈树林|顾凯迪|郑鹏飞|吴军|薛成

山东农业大学园艺科学与工程学院，中国山东省泰安市271018

摘要

梨是世界上最重要的水果作物之一，其果实品质受到石细胞含量的显著影响。CCCH型锌指蛋白在植物生长、发育和应激反应中起着核心作用；然而，它们在梨石细胞发育过程中的组织特异性表达模式和调控功能仍知之甚少。在这里，我们对梨中的CCCH型锌指基因家族进行了全基因组分析，鉴定出93个成员（PbrC3H1–PbrC3H93），并根据基因结构和系统发育关系将其分为12个亚家族。基因复制分析表明，家族扩张主要是由全基因组复制驱动的。通过对‘Dangshansuli’多个组织的转录组分析，发现7个PbrC3H基因在果实发育期间表达量较高。使用206个沙梨样本在石细胞形成关键阶段的转录组数据进行的共表达网络分析显示，PbrC3H45与木质素生物合成相关基因有强烈的共表达。通过同源和异源遗传转化系统的功能验证证实，PbrC3H45能够正向调控木质素生物合成。这些结果为理解梨中CCCH基因家族的进化及其组织特异性表达提供了全面的框架。值得注意的是，PbrC3H45被确定为石细胞木质化的关键调控因子，为梨果实品质的遗传改良提供了机制上的见解。

引言

锌指蛋白（ZFPs）是一类在真核生物中广泛存在的大型调控蛋白，它们能够特异性结合DNA、RNA或其他蛋白质，从而在转录和转录后调控中发挥核心作用（Berg和Shi，1996；Hall，2005）。它们的特征是锌指结构域，该结构域通过半胱氨酸和/或组氨酸残基协调锌离子而保持稳定构象（Moore和Ullman，2003；Peng等人，2012）。根据半胱氨酸（C）和组氨酸（H）残基的数量和排列，ZFPs被分为10个主要组：C2H2、C2HC、C2HC5、C2C2、C3H、C3HC4、C4、C4HC3、C6和C8（Kamaliyan和Clarke，2024；Moore和Ullman，2003；Wang等人，2022）。

CCCH锌指蛋白的特点是一个保守的基序，由三个半胱氨酸残基和一个组氨酸残基组成，通常遵循C-X_4-17-C-X_4-6-C-X₃-H的共识序列（其中X表示任意氨基酸，下标表示残基编号），最常见的形式是C-X₇-C-X₅-C-X₃-H和C-X₈-C-X₅-C-X₃-H（Berg和Shi，1996；Liu等人，2020）。根据基序组织，CCCH蛋白分为串联锌指蛋白（TZF，包含两个相邻的CCCH基序）和非串联锌指蛋白（Non-TZF，包含一个或多个非相邻的CCCH基序（Han等人，2021；Zhang等人，2020）。随着基因组测序技术的进步，已在许多植物物种中全基因组范围内鉴定出CCCH基因家族，包括拟南芥（A. thaliana）中的68个成员（Wang等人，2008）、水稻中的73个成员（Wang等人，2025）、玉米中的68个成员（Peng等人，2012）、大豆中的116个成员（Hu和Zuo，2021）、菠萝中的40个成员（Yang等人，2025）以及黄瓜中的38个成员（Uddin等人，2025），这突显了该基因家族的庞大性和进化动态性。

大量证据表明，CCCH蛋白作为植物生长、发育和应激反应的关键调控因子，通过转录和转录后机制在整个植物生命周期中发挥作用。在拟南芥中，AtPEI1在胚胎顶端区域特异性表达，对正常的胚胎形态发生至关重要（Li和Thomas，1998），而AtC3H17对种子萌发、幼苗生长、开花和种子发育具有多效性影响（Seok等人，2016）。在次生壁形成过程中，AtC3H14和AtC3H15在调节次生壁生物合成方面具有部分冗余作用（Chai等人，2015）。CCCH蛋白也在其他植物物种中发挥作用。水稻OsDOS的过表达显著延缓了叶片衰老（Kong等人，2006）；紫花苜蓿的MsZFN在长日照条件下抑制开花基因表达（Chao等人，2014）；大豆AtSZF1和AtSZF2的过表达显著提高了拟南芥的耐盐性，而棉花中的GhZFP1同样在转基因烟草中赋予了耐盐性（Guo等人，2009；Sun等人，2007）。对于干旱胁迫，PdC3H17的过表达提高了杨树的耐旱性（Zhuang等人，2019），而竹子中的PeC3H74在转基因植物中赋予了耐旱性（Chen等人，2020）。总体而言，这些发现强调了CCCH锌指蛋白在植物发育和环境适应中的多功能和不可或缺的作用。

梨（Pyrus属）是蔷薇科植物之一，是世界上最重要的经济作物之一，中国在其种植面积和产量方面均位居前列（Wu等人，2013）。石细胞是梨果实的一个决定性解剖特征，对果实的质地和食用品质有重要影响。这些细胞是由薄壁细胞通过次生壁增厚形成的特化厚壁细胞，其中木质素和纤维素是次生壁（SCW）的主要成分（Showalter，1993）。最近的研究揭示了梨果实中石细胞形成早期木质化的精细时空动态。石细胞在完全开花后10天（DAFB）开始木质化，其形成的凹陷导管在15 DAFB时诱导相邻细胞木质化，导致类似多米诺骨牌的簇状扩展，主要发生在75 DAFB之前（Zhu等人，2025）。另一项针对‘Dangshansuli’梨的研究监测了八个发育阶段的木质素和石细胞含量。结果显示，石细胞在21至63 DAFB期间迅速积累，然后在49 DAFB达到稳定水平，49 DAFB被确定为它们快速增殖的关键阶段（Xue等人，2019a）。总体而言，梨石细胞的木质化受到一个复杂的多基因调控网络的调节，其中几个转录因子如PbrNSC、PbrMYB169、PbrMYB24和PbrMADS1已被功能验证（Wang等人，2021；Xue等人，2019b，2023，2026）。然而，CCCH家族成员是否参与这一木质化过程仍不清楚。

在这项研究中，我们从‘Dangshansuli’的基因组中鉴定出93个CCCH基因家族成员，并进行了全面分析，包括系统发育分类、染色体定位、基因结构特征分析和复制模式评估。利用‘Dangshansuli’多个组织的转录组数据以及206个梨样本在石细胞形成关键阶段（49 DAFB）的果肉转录组数据，构建了PbrC3H基因与木质素生物合成相关基因之间的共表达网络。这种方法使我们能够确定PbrC3H45为一个关键候选基因，并对其在梨果实中调节石细胞木质化的作用进行了功能表征。这些结果共同提供了梨中CCCH基因家族的全面视图，并为石细胞性状的遗传改良奠定了坚实的基础。

章节片段

梨中CCCH锌指基因家族成员的鉴定

在本研究中，使用的梨基因组和蛋白质序列来自‘Dangshansuli’（Sun等人，2025）。使用PFAM数据库中的CCCH结构域（PF00642）的隐马尔可夫模型（HMM）来搜索PbrC3H蛋白（Eddy，2011）。为了确认鉴定出的蛋白质中存在CCCH结构域，还使用了多个数据库进行了额外的结构域分析，包括SMART（Letunic和Bork，2025）、InterPro（Blum等人，2025）和NCBI保守结构域数据库

PbrC3H转录因子家族成员的鉴定和特征分析

利用‘Dangshansuli’的全基因组序列，通过搜索CCCH结构域（PF00642）来鉴定CCCH家族基因。总共检测到93个CCCH锌指基因，并命名为PbrC3H1–PbrC3H93（表S2）。这些蛋白质的长度差异很大，从141个氨基酸（PbrC3H64）到2041个氨基酸（PbrC3H80）不等，平均长度为580个氨基酸，反映了该家族内部的结构多样性。

讨论

作为一类重要的转录因子，锌指蛋白在植物生长、发育和对生物胁迫的响应中起着关键的调控作用（Jan等人，2013；Kim等人，2021；Maldonado-Bonilla等人，2014）。其中，CCCH型锌指蛋白在RNA稳定性、转录调控和信号转导中起着关键作用（Pi等人，2018；Verma等人，2016；Xu等人，2020）。迄今为止，已在拟南芥、水稻等植物中鉴定出CCCH基因家族

结论

在这项研究中，从‘Dangshansuli’的基因组中鉴定出93个CCCH家族成员，并通过系统发育分析将其分为12个亚组。家族扩张主要是由全基因组复制事件驱动的，成员在染色体上的分布不均，反映了显著的遗传多样性。表达谱分析显示，在不同组织和发育阶段存在高度差异化的表达模式。通过整合多个组织和206个

CRediT作者贡献声明

钟潘：撰写——原始草稿，可视化，验证，项目管理，方法学，正式分析，数据管理。魏伟：正式分析。苏先伟：验证。陈树林：正式分析，数据管理。顾凯迪：方法学。郑鹏飞：方法学。吴军：撰写——审阅与编辑，监督，资金获取，概念构思。薛成：撰写——审阅与编辑，监督，资金获取，概念构思。

资助

本研究得到了中国国家自然科学基金（32230097，U24A20415，32472689）、中国农业研究系统专项基金（CARS-28）、山东省自然科学基金（ZR2024QC064）、山东农业大学高级人才研究基金以及山东农业大学“一流学科”建设项目的资助。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。