吸入载I型胶原酶脂质体(Inhaled collagenase I liposomes, CLP)通过局部胶原降解逆转肺纤维化(Pulmonary Fibrosis, PF)

《Acta Pharmaceutica Sinica B》：Inhaled collagenase I liposomes reverse pulmonary fibrosis via local collagen degradation

　　

肺纤维化（Pulmonary Fibrosis, PF）以过量胶原沉积及黏液堆积为特征，不仅损害氧合功能，还阻碍治疗药物的有效递送。I型胶原酶（Collagenase I）可特异性降解胶原，但其现有剂型（即局部注射）无法到达肺部。本研究制备了负载I型胶原酶的脂质体（collagenase I-loaded liposomes, CLP）用于PF的吸入治疗。CLP经逆向蒸发法制备，具近100%包封率、较小平均粒径（66.45 nm）、高酶活性（102.29 U/mL）、适宜空气动力学直径（3.79 μm）及高肺沉积率（微细粒子分数 Fine Particle Fraction, FPF 52.42%）。与游离I型胶原酶溶液（collagenase I solutions, CS）不同，CLP可快速穿透模拟肺黏液厚层，抑制MRC-5成纤维细胞增殖且不影响BEAS-2B上皮细胞。CLP可特异性降解切除的肺纤维化组织中的胶原，对正常肺组织无明显损伤。在博来霉素（bleomycin）诱导的PF小鼠模型中，CLP气管内给药显著使肺组织结构、运动行为及肺功能恢复正常，并提高生存率。典型纤维化标志物（I型胶原 Col I、III型胶原 Col III、α-平滑肌肌动蛋白 α-SMA、纤连蛋白 Fibronectin, FN、胶原面积分数）、促炎细胞因子及免疫相关因子随胶原清除而下降。吸入CLP可通过高效纤维化组织穿透及局部胶原降解逆转PF。

论文解读：吸入载I型胶原酶脂质体通过局部胶原降解逆转肺纤维化

《Inhaled collagenase I liposomes reverse pulmonary fibrosis via local collagen degradation》由Tongtong Zhang、Bo Zhuang、Hui Zhang、Feng Zhang、Lina Du、Bochuan Yuan及Yiguang Jin完成，发表于《Acta Pharmaceutica Sinica B》。肺纤维化（Pulmonary Fibrosis, PF）是一种进行性致死性肺病，病理特征为间质内胶原纤维（主要是I型和III型胶原）过度沉积，导致肺泡结构破坏、肺组织僵硬及气体交换障碍。现有抗纤维化药物如吡非尼酮（pirfenidone）和尼达尼布（nintedanib）仅能轻度延缓病程，无法逆转已形成的纤维化或恢复肺弹性；加之纤维化肺部分泌的高黏附黏液形成药物递送屏障，且全身给药易产生脱靶毒性。I型胶原酶（Collagenase I）虽能特异性切割天然胶原三螺旋结构降解病理性胶原沉积，但存在血液循环中不稳定、被网状内皮系统快速清除及全身应用致关节、皮肤等富含胶原器官损伤的风险，无法通过局部注射到达肺部病灶。基于此，研究人员提出将Collagenase I包载入脂质体（liposomes）制备吸入制剂，利用脂质体纳米尺寸及可变形性穿透肺黏液屏障并在纤维化灶滞留，实现局部胶原降解并降低全身副作用，探讨其逆转PF的可行性。

主要关键技术方法：

研究人员采用改良逆向蒸发法（reverse-phase evaporation）制备载I型胶原酶脂质体（CLP），以蛋黄卵磷脂与胆固醇为膜材，包封Collagenase I后冻干；以动态光散射（DLS）、透射电镜（TEM）、Next Generation Impactor（NGI）表征粒径、电位、形态及空气动力学粒径与微细粒子分数（Fine Particle Fraction, FPF）；体外通过人工肺黏液渗透实验、体外释放实验对比CLP与游离胶原酶溶液（CS），以CCK-8、活/死染色、流式细胞术检测对人胚肺成纤维细胞MRC-5及人正常肺上皮细胞Beas-2B的细胞毒性；离体孵育健康及博来霉素（bleomycin）诱导纤维化小鼠肺组织切片，行Masson染色及I型胶原（Col I）、III型胶原（Col III）免疫荧光评估胶原降解选择性；体内采用C57BL/6小鼠建立bleomycin诱导PF模型，气管内（intratracheal, i.t.）给予CLP、CS或生理盐水，监测体重、生存率、旷场实验（open field test）、转棒实验（rotarod test）及肺功能（forced vital capacity FVC、functional residual capacity FRC、total lung capacity TLC、chord compliance Cc），取肺组织行H&E、Masson、天狼星红（Sirius Red, SR）偏振光、Col I/Col III/FN免疫荧光、Western blot检测α-SMA、ELISA检测羟脯氨酸（Hydroxyproline, HYP）、TGF-β1、IL-1β及外周血白细胞计数、血清IgG、肺组织CD4⁺/CD8⁺T细胞免疫荧光。

研究结果：

3.1. Characteristics of CLP（CLP的理化及吸入特性）

CLP呈典型囊泡结构，平均粒径59.89 ± 14.58 nm（PDI 0.26 ± 0.03），Zeta电位近中性（0.98 ± 1.19 mV），CS为负电（-11.93 ± 0.45 mV）且与肺黏液（约-3.84 mV）存在静电排斥，近中性CLP利于穿透黏液。CLP包封率近100%，酶活性102.29 ± 5.45 U/mL，4℃贮存12个月稳定性良好。在PBS中CLP呈缓释（3 h持续释放），在人工肺黏液中CS因电荷排斥释放受阻（6 h仅~25%释放），而CLP 6 h内完全释放。雾化后质量中值空气动力学直径（Mass Median Aerodynamic Diameter, MMAD）为3.79 μm，FPF达52.42%，适于深肺沉积。体内荧光示踪显示CLP肺滞留时间长达6 h（CS 3 h即明显消退），且CLP全身（肝、肾）分布少于CS，证实长肺滞留与低脱靶。

3.2. Effect of CLP on fibroblasts and epithermal cells（CLP对成纤维细胞与上皮细胞的作用及体内安全性）

CLP与CS均呈浓度依赖性抑制MRC-5成纤维细胞活力（50 U/mL时CS组8.49%、CLP组28.79%），诱导>90%凋亡并破坏三维细胞聚集体，源于胶原降解影响成纤维细胞贴附生长；而对Beas-2B上皮细胞，即使50 U/mL仍维持近100%活力（100 U/mL时CLP 92.0%、CS 73.8%），表明选择性安全。健康小鼠多次气管给予CLP未引起肺功能（FVC、Cc）、血常规及肺组织学异常，CS早期有一过性肺功能下降但可逆，证实CLP吸入安全性良好。

3.3. Highly efficient mucus penetration and fibrotic collagen degradation of CLP（CLP的高效黏液穿透与纤维化胶原降解能力）

人工肺黏液穿透实验中CLP 6 h穿透整根毛细管而CS需24 h；黏蛋白平板上CLP 12 h形成透明水解区而CS无变化。离体纤维化肺组织孵育显示CS仅降解组织边缘Col I与Col III，CLP可从外周深入中心几乎完全降解两种胶原，且对正常肺组织胶原无明显影响，证实CLP具优异黏液/组织穿透力及病灶胶原选择性降解能力。

3.4. CLP restores the healthy state of PF mice（CLP恢复PF小鼠健康状态）

Bleomycin诱导PF模型小鼠体重下降、活动减少、生存率降低（模型组最终40%）。CLP组自给药第1天始体重回升，生存率提升至70%（CS组60%），转棒实验掉落次数与潜伏时间从第5天起恢复至健康鼠水平（与模型组比P < 0.05或P < 0.01），旷场实验总移动距离、中央区停留时间及进入次数在第7、14天与健康组无显著差异且优于CS与空白脂质体组，表明CLP改善全身状况与运动行为能力。

3.5. CLP reverses fibrosis and restores pulmonary function（CLP逆转纤维化并恢复肺功能）

Masson染色示模型组大量蓝染胶原，CLP组胶原面积分数降至与健康组无差异（P > 0.05），且低于CS组（P < 0.05）；天狼星红偏振光、Col I/Col III/FN免疫荧光均显示CLP使纤维化标志物接近正常。肺组织HYP含量与α-SMA蛋白表达CLP组显著低于模型组（P < 0.01、P < 0.05），与健康组相当。肺功能指标FRC、TLC、Cc在CLP组较模型组明显改善（部分时点优于CS组，P < 0.05），证实CLP逆转已形成的胶原沉积并恢复肺顺应性与容积。

3.6. CLP reduces inflammation by fibrotic collagen clearance（CLP通过胶原清除减轻炎症）

PF模型肺组织TGF-β1、IL-1β升高，外周血白细胞（WBC）及血清IgG增高，CD4⁺/CD8⁺T细胞浸润增多；CLP处理后上述促纤维化细胞因子（TGF-β1、IL-1β）、WBC计数、IgG水平及T细胞浸润均显著下调至近正常水平（与模型组比P < 0.05或P < 0.01），表明胶原清除打断炎症—纤维化正反馈环路。

讨论与结论翻译（Conclusions）：

PF是严重致死性疾病，尚无特效药。研究人员分析PF病理基础为过量胶原沉积这一独特特征，认为胶原降解可能是解决这一棘手问题的途径。研究发现，吸入I型胶原酶脂质体（CLP）可通过直接肺部给药、高效穿透肺黏液及纤维化组织、局部缓释并最终高效降解局部胶原，来解决PF问题。该策略有望为PF患者提供新的生存途径。