负载 db-cAMP 的微针贴片局部递送通过 CREB/PI3K/AKT 信号轴促进脊髓损伤修复

《Engineering》：Localized Delivery of a Microneedle Patch Loaded with db-cAMP Promotes Spinal Cord Injury Repair through the CREB/PI3K/AKT Signaling Axis

　　

脊髓损伤（SCI）后，星形胶质细胞向补体成分 3 阳性（C3⁺）神经毒性 A1 表型的极化，是炎症级联反应的重要特征，其在加重神经元衰老、抑制轴突再生及限制功能恢复方面发挥关键作用。尽管环磷酸腺苷（cAMP）信号已被提示参与调控星形胶质细胞活化，但调节 C3⁺ 星形胶质细胞分化及其下游神经炎症效应的精确分子通路仍未得到充分阐明。本研究鉴定出 cAMP 反应元件结合蛋白（CREB）是调控星形胶质细胞极化的关键调节因子。采用可透膜的 cAMP 类似物二丁酰基-cAMP（db-cAMP）激活 CREB 后，体外 24 h 内 C3⁺ 星形胶质细胞数量降低 43%，C3 蛋白表达下降 15%。在功能层面，抑制神经毒性星形胶质细胞可缓解神经元衰老，并通过减少经典活化巨噬细胞（M1 巨噬细胞）极化、增强替代活化巨噬细胞（M2 巨噬细胞）反应以及促进凋亡细胞清除（efferocytosis，指吞噬并清除凋亡细胞）来重塑免疫微环境。转录组学分析及通路富集分析进一步揭示，CREB/磷脂酰肌醇 3-激酶（PI3K）/蛋白激酶 B（AKT）信号轴介导了星形胶质细胞的抗炎性与神经保护性重编程。研究人员进一步构建了一种具有黏附性的微针贴片（db-cAMP@MP），可将 db-cAMP 持续、靶向递送至受损脊髓病灶部位，以在体内实现对星形胶质细胞表型的局部治疗性调控。SCI 后应用 db-cAMP@MP 可有效激活脊髓星形胶质细胞中的 CREB 信号，进而减少 C3⁺ 星形胶质细胞聚集、降低神经元衰老标志物表达，并使运动诱发电位（MEP）振幅提高 1.4 倍，促进运动功能恢复；在 SCI 模型中，Basso 小鼠评分（BMS）达到 3.8 ± 0.83。上述结果确立了 CREB 作为星形胶质细胞驱动神经炎症的核心分子开关，并表明 db-cAMP@MP 是一种有前景的精准靶向治疗平台，可用于调控星形胶质细胞表型并促进 SCI 后功能修复。

该文发表于《Engineering》，聚焦脊髓损伤（SCI）后神经炎症微环境失衡这一核心病理过程。脊髓损伤发生后，中枢神经系统（CNS）内大量星形胶质细胞被激活，并发生反应性转化。既往研究已表明，星形胶质细胞可向不同功能状态极化，其中以补体成分 3（C3）高表达为特征的 A1 型星形胶质细胞具有显著神经毒性，可通过放大炎症级联、促进胶质瘢痕形成以及抑制轴突再生而加重继发性损伤；相对地，A2 型则更偏向神经保护与组织修复。因此，如何抑制 C3⁺ A1 星形胶质细胞形成、重塑损伤后微环境，已成为 SCI 干预的重要方向。与此同时，cAMP 反应元件结合蛋白（CREB）在神经元存活、轴突再生和突触可塑性中的作用已有一定认识，但其内源性激活是否能够调控星形胶质细胞极化，尤其是否通过明确分子轴影响神经元衰老与巨噬细胞反应，仍缺乏系统证据。此外，小分子药物在脊髓局部递送方面还面临血-脊髓屏障（BSCB）阻隔、系统暴露和半衰期短等现实瓶颈，因此开发兼具机制针对性与递送可行性的局部治疗平台具有重要意义。

围绕上述问题，研究人员以 db-cAMP 作为可透膜的 cAMP 类似物激活内源性 CREB，系统评估其对星形胶质细胞 C3⁺ 神经毒性极化、神经元衰老、巨噬细胞极化与凋亡细胞清除能力的影响，并结合转录组学进一步解析其下游信号机制。研究进一步构建负载 db-cAMP 的黏附性微针贴片（db-cAMP@MP），将其应用于小鼠脊髓挫伤模型，以验证局部持续递送在体内对病灶微环境调控与功能恢复的促进作用。研究结果表明，CREB 是调控 C3⁺ 星形胶质细胞形成的关键上游分子，db-cAMP 可通过激活 CREB/PI3K/AKT 信号轴抑制神经毒性星形胶质细胞极化，并减轻神经元衰老、促进巨噬细胞向修复相关表型转化及增强凋亡细胞清除功能。更重要的是，微针贴片实现了 db-cAMP 在损伤脊髓局部的精准持续释放，显著改善了运动功能和电生理指标。这项研究不仅从机制上深化了对 SCI 后星形胶质细胞主导神经炎症的认识，也提出了具有转化潜力的材料递送治疗策略。

就主要技术方法而言，研究人员首先分离培养 P1–P2 C57BL/6J 小鼠原代星形胶质细胞、E17–19 胚胎小鼠原代神经元及骨髓来源巨噬细胞（BMDMs），建立脂多糖（LPS）诱导的星形胶质细胞神经毒性模型，并通过条件培养基（ACM）共培养评估对神经元衰老和巨噬细胞功能的影响；采用 Western blot、RT-qPCR、免疫荧光、SA-β-gal 染色、流式细胞术及 RNA 测序（RNA-seq）解析分子机制；以短发夹 RNA（shRNA）和 PI3K 抑制剂 LY294002 验证 CREB/PI3K/AKT 通路作用；构建由 GelMA 与 HA-DA 组成的 db-cAMP@MP，并在 8 周龄雌性 C57BL/6J 小鼠脊髓挫伤模型中，结合组织学、BMS、CatWalk 与 MEP 评价疗效和安全性。

在结果部分，论文首先以“db-cAMP reduces the LPS-induced neurotoxic activation of astrocytes”为主题，说明 db-cAMP 对炎症刺激下星形胶质细胞表型转化具有直接调控作用。研究人员分离获得高纯度原代星形胶质细胞后发现，db-cAMP 可促进星形胶质细胞增殖，其效应在 1 mmol·L^–1 时趋于平台。进一步检测显示，db-cAMP 处理后 p-CREB 水平明显升高，提示 CREB 被成功激活。在 LPS 诱导神经毒性激活的背景下，db-cAMP 显著下调 C3 和 TNF-α 的 mRNA 表达，并在蛋白水平抑制 C3 上调。该结果表明，db-cAMP 能够通过激活 CREB 减轻炎症诱导的 A1 型神经毒性星形胶质细胞反应，使星形胶质细胞向更有利于修复的方向转变。

在“db-cAMP rescues neurotoxic astrocyte-induced neuronal senescence”部分，研究人员将不同处理条件下星形胶质细胞来源的条件培养基作用于原代神经元，以评估星形胶质细胞分泌环境对神经元衰老的影响。结果显示，LPS 刺激星形胶质细胞所得 ACM 明显增强衰老相关 β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色，并增加 p21 阳性神经元数量；而来源于 LPS + db-cAMP 处理组的 ACM 则显著减轻上述改变。进一步在转录和蛋白水平检测到 p21 与 γH2AX 均被显著下调，说明神经毒性星形胶质细胞分泌谱可诱导神经元进入衰老状态，而 db-cAMP 通过重塑星形胶质细胞表型削弱了这一不良旁分泌效应。

在“LPS-stimulated ACM promotes M1 macrophage polarization and inhibits efferocytosis”部分，研究人员进一步考察星形胶质细胞分泌环境对巨噬细胞炎症表型与清除功能的影响。使用 RAW264.7 细胞进行极化标志基因分析后发现，LPS 刺激星形胶质细胞来源的 ACM 可明显上调 TNF-α、IL-6 和 iNOS 等 M1 相关基因，而 db-cAMP 干预后的 ACM 则促进 IL-10、CD206 和 Arg1 等 M2 相关基因表达。随后在原代 BMDMs 与凋亡 HT22 神经元的体外吞噬实验中，研究人员观察到接受 LDB 处理 ACM 的巨噬细胞具有更强的 efferocytosis 能力，流式细胞术证实其凋亡细胞清除比例显著增加。该部分结果说明，神经毒性星形胶质细胞不仅影响神经元状态，还会推动巨噬细胞向促炎表型偏移并削弱损伤清除功能，而 db-cAMP 可通过改变星形胶质细胞分泌环境逆转这种免疫失衡。

在“db-cAMP attenuates C3⁺ astrocyte polarization after LPS treatment through activation of CREB/PI3K/AKT signaling”部分，研究人员利用 RNA-seq 解析分子机制。差异表达分析与京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集结果显示，LPS 处理后受抑制的 PI3K/AKT 信号在 db-cAMP 干预后被重新激活。蛋白检测进一步证实，LDB 组中 p-PI3K 和 p-AKT 水平均明显升高。关键的是，加入 PI3K 抑制剂 LY294002 后，db-cAMP 对 C3 表达的抑制作用被消除，提示 PI3K/AKT 活化是其抑制 C3⁺ 星形胶质细胞极化所必需的。随后，研究人员通过 shRNA 敲低 CREB，观察到 p-PI3K 和 p-AKT 表达下降，且 C3 表达回升，证明 CREB 位于 PI3K/AKT 上游，是驱动该保护性信号通路并抑制神经毒性极化的关键分子。由此，论文建立起 CREB/PI3K/AKT 信号轴介导星形胶质细胞表型重编程的机制框架。

在“Characterization and biocompatibility of db-cAMP@MP”部分，论文转向递送系统构建。研究人员采用 GelMA 水凝胶针尖与 HA-DA 水凝胶基底设计黏附性微针贴片，并通过氢核磁共振（HNMR）验证两种材料的成功合成与修饰，其中 HA-DA 的多巴胺接枝效率约为 24%。扫描电子显微镜（SEM）显示微针阵列结构均一，底部直径约 250 μm，高度约 600 μm。载药后体外释放实验提示 db-cAMP 可持续释放 7 d，且药物包载不影响机械性能。生物相容性方面，db-cAMP@MP 与神经元、星形胶质细胞及小胶质细胞共培养 24、48、72 h 均未见明显细胞毒性；体内硬膜外应用 6 周后，主要脏器组织学和血清生化指标亦未见异常。此外，与腹腔注射相同剂量 db-cAMP 相比，微针贴片在损伤局部诱导了更强的 p-CREB 激活，说明该平台可绕过 BSCB，实现更有效的局部递送与持续生物学作用。

在“db-cAMP@MP alleviates neuronal senescence and enhances functional recovery after SCI”部分，研究人员在小鼠脊髓挫伤后立即于病灶处应用 db-cAMP@MP，并于伤后 6 周评估组织修复与功能恢复。免疫荧光结果显示，db-cAMP@MP 使损伤区 p-CREB 阳性星形胶质细胞数量增加 3.5 倍，同时使 C3⁺ 星形胶质细胞减少 53%，证明该递送系统在体内同样可激活 CREB 并抑制神经毒性极化。神经元衰老方面，病灶区衰老神经元数量明显减少，NeuN/γH2AX 双阳性细胞下降 57%，p21 相关结果亦支持这一结论。与此同时，伤后 7 d 脊髓切片中 Arg1/F4/80 染色显示 M2 巨噬细胞增加 2.1 倍，提示局部炎症环境被重新塑造为更有利于修复的状态。功能学评价进一步显示，db-cAMP@MP 组自伤后 14 d 起 BMS 评分即优于未治疗组，至 6 周时达到 3.8 ± 0.83，而 SCI 对照组仅为 2.0 ± 0.71。CatWalk 步态分析显示后肢接触强度、接触面积、足印宽度等指标均明显改善，MEP 振幅亦显著增高。以上结果共同表明，db-cAMP@MP 不仅改善分子与细胞层面的病理过程，也能够促进行为学和电生理水平的功能恢复。

讨论部分围绕 SCI 后星形胶质细胞主导的神经炎症网络进行了系统归纳。研究指出，C3⁺ A1 星形胶质细胞不仅直接加剧神经元损伤，还通过其分泌环境诱导神经元衰老、推动巨噬细胞向 M1 偏移并削弱 efferocytosis，从而维持慢性促炎状态并阻碍组织修复。db-cAMP 激活内源性 CREB 后，可显著抑制 A1 型星形胶质细胞，降低 TNF-α、IL-6、iNOS 等促炎分子，提升 CD206、IL-10、Arg1 等修复相关分子表达。机制上，CREB/PI3K/AKT 轴是这一效应的核心通路，CREB 敲低或 PI3K 抑制均会削弱 db-cAMP 的保护作用。论文同时强调，星形胶质细胞条件培养基是连接神经元衰老与免疫反应的关键介质，其中 C3a/C3aR 旁分泌通讯可能是重要环节，但作者也指出除该通路外仍可能存在其他炎症和免疫调节因子参与。递送层面，文章认为 db-cAMP@MP 通过黏附性双水凝胶微针结构实现了局部高效、持续且低系统暴露的给药方式，克服了系统给药难以跨越 BSCB、鞘内给药清除过快等问题，并在安全性与疗效之间取得良好平衡，体现出较强转化前景。

结论部分可译为：总之，本研究揭示 CREB/PI3K/AKT 信号通路是调控 C3⁺ 诱导的神经毒性星形胶质细胞分化的关键机制，并影响神经元衰老、巨噬细胞极化以及凋亡细胞清除功能障碍等重要病理过程。与此同时，研究提出一种采用 db-cAMP@MP 进行 db-cAMP 局部递送的新型治疗策略，为调控神经炎症微环境和促进脊髓修复提供了微创且有效的平台。通过靶向星形胶质细胞可塑性并增强神经再生，该研究不仅推进了对 SCI 病理机制的理解，也突出了具有临床转化潜力的可行干预路径。