《ACS Applied Nano Materials》：Gold-Nanoparticle-Based Localized Surface Plasmon Resonance Sensor Integrating Microfluidics for Dual Cardiovascular Disease Biomarker Detection
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局域表面等离子体共振（localized surface plasmon resonance, LSPR）技术在生物传感应用中显示出显著潜力，主要归因于其紧凑、实时、无标记和高灵敏度的特性。在本研究中，研究人员提出了一种纳米制造工艺，该工艺包含两个金沉积步骤，
局域表面等离子体共振（localized surface plasmon resonance, LSPR）技术在生物传感应用中显示出显著潜力，主要归因于其紧凑、实时、无标记和高灵敏度的特性。在本研究中，研究人员提出了一种纳米制造工艺，该工艺包含两个金沉积步骤，随后进行快速热退火（rapid thermal annealing, RTA）处理，被定义为双RTA处理LSPR传感器制造方法。该制造工艺能够实现金层优化，以获得致密且均匀的纳米颗粒再分布，从而产生高LSPR效应。研究人员通过扫描电子显微镜（scanning electron microscopy, SEM）图像和紫外-可见光谱（UV–vis spectroscopy）分别分析了每种制造情况下的纳米颗粒分布和消光光谱。基于表面形貌，研究人员提出了两种纳米颗粒生长机制，即颗粒聚并（particle coalescence）和形核（nucleation），以解释纳米颗粒的形成。随后，对12种情况的光谱进行了比较。结果表明，第一层8 nm金层后接第二层4 nm金层（8 + 4 nm）的RTA LSPR传感器能够实现最高的灵敏度（sensitivity）和品质因数（figure of merit, FOM）。最后，研究人员将8 + 4 nm RTA LSPR传感器与微流控技术集成，用于检测两种心血管疾病（cardiovascular disease, CVD）生物标志物：心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I, cTnI）和N末端B型钠尿肽前体（N-terminal pro-B-type natriuretic peptide, NT-proBNP）。结果显示，该传感器能够实现cTnI和NT-proBNP的实时连续测量，检测范围分别为1 pg/mL至10 ng/mL和10 pg/mL至10 ng/mL，均处于临床阈值范围内。基于上述特性，研究人员预期该双RTA处理LSPR传感器能够为基于即时检验（point-of-care）的CVD诊断应用提供一种无标记、高灵敏度且简便的光学传感方法。
心血管疾病（cardiovascular disease, CVD）是全球范围内导致死亡的主要原因之一，在成年人群中构成了重大的公共卫生负担。CVD涵盖了一系列 adversely 影响心脏和血管系统的疾病，包括缺血性卒中、脑出血和高血压性心脏病。目前，精确监测心脏生物标志物水平是实现CVD快速早期诊断的一种有前景的方法。CVD生物标志物的定量可用于评估生理状况，促进对病理状态下生物反应的实时监测以及医疗干预后的随访评估。已确立的CVD生物标志物如心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I, cTnI）和N末端B型钠尿肽前体（N-terminal pro-B-type natriuretic peptide, NT-proBNP）与CVD背景下的心肌缺血和心力衰竭（heart failure, HF）密切相关，在临床实践中常规用于诊断和预后目的。在医院和临床实验室中，cTnI和NT-proBNP的临床检测主要采用化学发光微粒子免疫分析（chemiluminescence microparticle immunoassay, CMIA）和电化学发光免疫分析（electrochemiluminescence immunoassay, ECLIA），这些方法具有高灵敏度、高特异性和高通量的特点。然而，上述方法通常需要多步样本处理，且需借助 bulky 仪器和经过良好培训的技术人员操作，使得实时、便携和具有成本效益的CVD诊断难以实现。
与上述技术相比，等离激元检测方法具有快速、动态和连续传感的特点，适用于生物传感应用。此外，其无标记特性还可以最大程度地减少劳动密集型和繁琐的样本制备过程。常见的等离激元检测方法包括：（1）表面等离子体共振（surface plasmon resonance, SPR）；（2）表面增强拉曼光谱（surface-enhanced Raman spectroscopy, SERS）；以及（3）局域表面等离子体共振（localized surface plasmon resonance, LSPR）。在上述方法中，LSPR因其简化的光学设置和极小的样本体积要求而备受关注，在即时检验场景中显示出巨大潜力。此外，由于LSPR事件发生在纳米结构附近，其微小的传感位点有望在小面积内实现多重或多并行传感。一种简单的LSPR传感格式是基于化学合成产生胶体纳米颗粒（nanoparticles, NPs）。然而，该方法可能存在NPs聚集的问题，且无法实现高通量和多重传感特性。取而代之的是，表面限域的NPs阵列或金属纳米结构是替代方法。为诱导更强的LSPR效应，先进的纳米制造或纳米材料合成方法，包括纳米球刻蚀（nanosphere lithography, NSL）、纳米压印光刻（nanoimprinted lithography, NIL）和电子束光刻（electron beam lithography, EBL），被用于生成具有精确控制形状和几何结构的金属纳米结构。然而，这些纳米制造方法的工艺相当复杂，且无法大面积制造纳米结构。相比之下，快速热退火（rapid thermal annealing, RTA）处理是一种简单且经济有效的方法，可用于制造大面积纳米结构阵列。
受上述研究启发，研究人员提出了一种包含两个独立金沉积步骤的纳米制造工艺。基于表面功能化抗体的金纳米颗粒LSPR传感器可用于基于消光光谱变化的分析物检测。通过引入第二次RTA处理，可以进一步优化纳米颗粒的物理参数，包括其形状、间隙和排列，从而产生高LSPR效应。为实现这一目标，研究人员系统调整了两个顺序层的沉积厚度（4、6或8 nm），随后进行RTA处理。基于纳米颗粒轮廓，研究人员提出了两种纳米颗粒生长机制：（1）颗粒聚并：在第一层沉积较薄、第二层沉积较厚的情况下观察到；（2）形核：在第一层沉积较厚、第二层沉积较薄的情况下观察到。上述纳米颗粒生长模式比单步金沉积和RTA获得的结构更加致密和均匀，从而产生更强的LSPR效应。基于系统分析，研究人员选择了8 + 4 nm制造参数，该参数具有最佳的灵敏度和品质因数（figure of merit, FOM），用于后续生物传感实验。与先前报道的单步RTA LSPR传感器相比，该LSPR传感器的均匀性、灵敏度和FOM均得到改善。
为展示CVD生物标志物检测能力，研究人员将LSPR传感器与微流控技术集成，并通过自动化微流控控制系统操作，以检测两种CVD生物标志物：cTnI和NT-proBNP。该系统由三个单元组成：（1）光学单元，包括钨卤灯光源、两根直径600 μm的光纤用于引导激发光，以及紫外-可见光谱仪用于收集透射光；（2）微流控控制单元，基于LabSmith平台构建，实现自动化和程序化流体处理；（3）传感单元，包括X-Y轴电动平台、LSPR传感器和由数控加工机床制造的聚甲基丙烯酸甲酯（polymethyl methacrylate, PMMA）定位板。PMMA板左上角包含一系列定位孔，作为参考点以在传感器更换期间保持一致的扫描路径。
LSPR传感器的功能化方案基于先前研究修改，包括三个步骤。第一步涉及自组装单层（self-assembly monolayer, SAM）的固定。首先，将传感器浸入30 mM的11-巯基十一烷酸（11-mercaptoundecanoic acid, 11-MUA）溶液中，在4°C下8-12小时以形成均匀的羧基功能团用于后续共价偶联。然后，用0.3 M 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（1-ethyl-3-(3-(dimethylamino)propyl)carbodiimide, EDC）和0.6 M N-羟基琥珀酰亚胺（N-hydroxysuccinimide, NHS）在0.1 M MES缓冲液中的混合物活化11-MUA，产生活性NHS酯。第二步为抗体固定化。在该步骤中，使用87.5 μg/mL的cTnI抗体和200 μg/mL的NT-proBNP抗体，分别以4 μL/min的流速引入，促进与活化表面的共价结合。第三步为抗原检测，将各种浓度的抗原溶液以5 μL/min的流速引入传感器表面。
在表面形貌分析方面，研究人员系统评估了12种双RTA处理LSPR传感器的制造情况。基于SEM图像分析，研究人员提出了两种纳米颗粒形成机制来解释分布特征。对于4 nm和6 nm情况，纳米颗粒形成可归因于颗粒聚并机制。该现象发生在初始纳米颗粒较小且颗粒间间距较窄时，第二层金沉积和RTA处理的纳米颗粒直接与初始纳米颗粒合并，形成更大且异质的纳米颗粒。另一种机制为形核，发生在初始纳米颗粒较大且颗粒间间距较宽时。第二沉积层的纳米颗粒倾向于填充初始纳米颗粒之间的间隙，而非与它们合并，导致双峰颗粒分布。研究表明，当底层纳米颗粒之间的间距小于两倍扩散长度时，间隙内不会形成新的颗粒；而在较大的未扰动距离处，退湿的薄膜会形核新的颗粒。
光谱数据分析表明，在所有情况中，8 + 4 nm情况能够达到最高的灵敏度（257.38 nm/RIU）和FOM（2.69/RIU），相较于8 nm情况有2-3倍的提升。研究人员认为这一性能提升归因于形核纳米颗粒形成机制，该机制在二次RTA处理后产生了更均匀的纳米颗粒形状和高度致密的纳米颗粒分布。
在均匀性和稳健性测试方面，研究人员进行了片内和片间变异性测试。结果表明，在单个1.5 cm × 1.5 cm的LSPR传感器中，16个不同传感位点的光谱轮廓、峰位置和消光强度无显著差异；四片8 + 4 nm RTA LSPR传感器的比较也显示出可接受的峰波长和消光谱差异。在稳健性测试中，连续以5 μL/min流速流动PBS缓冲液3小时，LSPR峰波长保持高度稳定，仅出现可忽略的波动。
在cTnI和NT-proBNP检测方面，8 + 4 nm RTA LSPR传感器与微流控集成后，通过自动化微流控控制系统精确控制流速和试剂体积。优化后，确定cTnI抗体87.5 μg/mL和NT-proBNP抗体200 μg/mL为最佳传感浓度。实时波长位移曲线显示，cTnI检测范围从1 pg/mL到10 ng/mL，NT-proBNP检测范围从10 pg/mL到10 ng/mL，均处于临床阈值范围内。特异性测试中，先引入1000 ng/mL的C反应蛋白（C-reactive protein, CRP）作为干扰分子，结果显示其对光谱位移影响极小，证明了8 + 4 nm RTA LSPR传感器的高特异性。
在讨论部分，研究人员指出，虽然多步沉积和RTA过程可能进一步增强LSPR效应，但这种多步工艺可能缺乏时间和成本效率。此外，如果超过两步金沉积步骤，金层可能过厚而降低LSPR效应。向直接血清或血浆分析推进时，LSPR传感面临若干挑战。由于真实生物基质中含有众多蛋白质、脂质和细胞成分，可能诱导显著的光散射或非特异性吸附，潜在干扰LSPR信号。为弥合与真实临床样本的差距并实现即时检验诊断平台，未来工作将涉及开发集成微流控模块用于先进血液处理。微流控通道内的抗-D涂层抗体可促进红细胞的快速沉降。此外，在装置内集成过滤膜以排除大细胞碎片和干扰蛋白，确保纯化基质到达传感区域。表面封闭方案也需要优化，以改善富蛋白环境中的信噪比。通过将这些自动化样本制备策略与RTA处理LSPR传感器的高灵敏度相结合，旨在为快速心血管疾病诊断提供一种无标记且经济高效的解决方案。
研究结论指出，本研究成功展示了一种基于双RTA处理的LSPR传感器制造工艺。为确定优化的制造参数，研究人员系统调整了两个金层的沉积厚度，并利用SEM和UV–vis光谱评估了表面形貌和光谱。基于SEM图像，研究人员提出了颗粒聚并和形核两种纳米颗粒形成机制来解释纳米颗粒轮廓。与所有制造情况相比，研究人员选择了基于形核形成的8 + 4 nm RTA LSPR传感器，其具有最高的灵敏度（257.38 nm/RIU）和FOM（2.69/RIU），用于后续生物传感实验。与先前报道的单RTA LSPR传感器（188.9 nm/RIU）相比，由于双RTA处理产生的双峰纳米颗粒分布，更均匀的纳米颗粒轮廓和更窄的等效颗粒间隙（Geq）可导致更强的LSPR效应。使用该优化制造条件，研究人员随后展示了8 + 4 nm RTA LSPR传感器用于cTnI和NT-proBNP的生物传感能力。结果表明，cTnI和NT-proBNP的传感动态范围分别为1 pg/mL至10 ng/mL和10 pg/mL至10 ng/mL，处于临床阈值范围内。借助微流控控制系统，整个检测过程可以精确且连续地监测。分析物检测时间仅为18分钟，样本需求量仅90 μL。此外，传感器的均匀性和特异性也在单独的实验中进行了评估。
