综述：基于UPLC-Q-TOF-MS/MS和NMR技术的韩国冬季菠菜（Spinacia oleracea L.）叶生物活性组分酚类物质谱表征：优化提取条件下主要酚类化合物及其生物活性评价

《Antioxidants》：Characterization of Phenolic Profiles Using UPLC-Q-TOF-MS/MS and NMR in the Biofunctional Fraction of Korean Winter Spinach (Spinacia oleracea L.) Leaves: Evaluation of Major Phenolics and Their Bioactivities Under Optimized Extraction Conditions

　　

本综述考察了近年来集成光学与电化学通道的多功能探针在体外/体内研究中的最新进展。将电极与光学纤维整合可为局部光递送及单细胞内外代谢物的同步电化学检测提供有力平台。这类混合器件在相同实验装置内架接了光刺激方法（包括光遗传学）与细胞响应的电化学监测。该综述系统分类了不同的探针架构：用于胞内测量的光学纳米内窥镜、共享光电化学通道的探针、光学与电化学通道物理分离的器件，以及为神经接口和扫描探针显微镜设计的探针。针对每类架构，研究人员讨论了其制备方法、表面改性策略及代表性生物学应用。综述特别关注共享通道设计中光学透明性与电导率之间的基本矛盾、神经组织对可植入探针提出的机械要求，以及当前扫描探针平台的空间分辨率限制。最后，综述对这些技术的当前局限性与未来方向进行了批判性评估，包括更高空间分辨率、同步多路分析物检测以及这些技术向在体实验模型更广泛转化等方面。

## 1. 引言

纳米尺度单细胞研究器件因其能够以纳米级分辨率进行定量测量而备受关注。理解活细胞内的分子过程仍是现代生物医学的核心挑战之一。传统成像方法存在显著局限：电子显微镜需要样品固定，无法研究动态过程；荧光显微镜记录标记物位置而非靶分子本身，且不能直接测量细胞代谢物浓度。这些局限推动了基于可穿透细胞并进行局部实时测量的探针替代方案的发展。微电极和纳米电极在细胞生物学、光遗传学和电化学中已得到充分确立。纳米电极的减小双电层电容使其能够快速响应电化学信号并促进短寿命中间体（如活性氧和氮物质（ROS/RNS））的检测。这些电极的小尺寸和锥形或圆柱形几何结构允许最小侵入性的细胞内测量。尽管能够监测单细胞关键生化参数（ROS、pH、金属离子）的电化学传感器已取得进展，但将电化学测量与可控光学刺激相结合的技术仍处于早期发展阶段。特别重要的是将纤维电极尺寸减小至纳米尺度的进展。

光学纤维纳米内窥镜作为另一平行发展方向，允许高分辨率可视化并与单细胞相互作用。微电极和纳米电极与光学纤维的整合可实现光电化学反应，并在小体积（包括液滴、微乳液甚至单活细胞内）局部光照下对各种生化过程进行定量评估。光学纤维具有最小侵入性、高柔性、光直接递送至测量位点以及与电化学方法兼容等优势，使其成为细胞生物学中研究细胞内过程实时且不对细胞造成重大损伤的不可或缺的工具。因此，光学纤维已成为电分析化学中重要的互补工具，用于激活光敏过程并在生物系统中进行微纳米尺度的可视化。

此类混合器件应用广泛，从细胞代谢基础研究到光动力疗法效果评估方法的开发以及光遗传学神经接口。光学纤维与光遗传学等先进技术的整合为控制和研究单细胞开辟了新途径。例如，结合光纤和光遗传学技术的光学神经接口可实现体内精确的细胞类型特异性光学寻址，具有毫秒级时间分辨率。集成电极的光极（Optrode）具有独特优势，允许对同一神经元群体进行同步光学刺激和电记录。

## 2. 用于单细胞成像的光学纳米内窥镜

高分辨率单细胞可视化对从生物学到医学的众多科学学科至关重要。纳米尺度内窥镜（纳米内窥镜）提供对细胞内环境的最小侵入性访问。根据检测原理，纳米内窥镜可分为电化学型、光学型、电生理型或拓扑型。近期许多工作将其中几种模态组合。

玻璃纳米毛细管是构建光学纳米内窥镜最广泛使用的平台，可从石英或硼硅酸盐毛细管拉制而成，并能适应广泛任务。在光学成像中，纳米毛细管作为量子点或等离激元纳米粒子的载体，增强表面增强拉曼散射（SERS）信号并实现细胞代谢物的高灵敏分析。扫描离子电导显微镜（SICM）中纳米毛细管的使用可实现细胞表面拓扑成像和局部电化学测量的同步进行。

蚀刻或拉制的单模光学纤维代表另一种提供亚细胞分辨率且无需外部光学的替代平台。Cheemalapati等人开发的单模光纤纳米内窥镜由化学蚀刻光纤构成，基部直径8 μm，锥化至~200 nm，实现亚细胞水平光的递送和收集，无需使用外部物镜光学。研究实验证明了成纤维细胞核、Hoechst标记肝细胞和MDA-MB-231线粒体的荧光光谱局部记录，以及YFP表达秀丽隐杆线虫的体内信号收集。

Yan等人提出的纳米线内窥镜由直径100–250 nm的一维SnO₂波导组成，连接至直径300–500 nm的锥形蚀刻单根光学纤维。小直径和机械柔性最小化了对膜和细胞骨架的损伤。该纳米内窥镜的关键能力是高空间分辨率的亚细胞结构选择性可视化，成功分辨了活细胞内仅相距2 μm的两个量子点簇。与激发整个细胞膜且具有高背景信号的传统宽场落射荧光显微镜相比，纳米内窥镜提供了靶向的局部照明。研究还证明了量子点向核或细胞质的时空递送，并在UV照射1分钟内激活光可切割连接体。

Singhal等人开发了基于碳纳米管的多功能细胞内窥镜，实现细胞研究、流体运输以及细胞器水平的联合光学和电化学诊断。该设计由多壁碳纳米管（长50–60 μm，外径50–200 nm）通过环氧树脂连接至玻璃微毛细管末端，两端保持开放用于流体运输。与常规锥形玻璃毛细管相比，圆柱形纳米管几何结构允许更深细胞穿透，空间分辨率约100 nm，置换细胞材料少50–1000倍，并实现超过30分钟的持续细胞内探测而不破坏细胞骨架或扰动细胞钙稳态。

Wen等人报道了多模光纤光学内窥镜的重大进展，开发了空间频率跟踪自适应信标光场编码（STABLE）内窥镜技术，通过单根细多模光纤实现体内成像，达到250 nm的亚衍射空间分辨率。该技术通过光纤与成像信号同轴传播参考光束——空间频率信标。由于该信标在光纤近端的傅里叶平面始终聚焦至单一可预测点，任何机械扰动都会导致该焦点发生可测量的位移，从而实现传输矩阵的实时更新，速率高达1 kHz。全矢量光调制结合荧光发射差分检测进一步提升了信噪比。该设计直接解决了多模光纤的关键局限性：其对弯曲和机械扰动的极端敏感性，此前这阻碍了稳定的内窥镜成像。在支气管模型中展示了跨尺度成像，并在小鼠模型中验证了体内亚细胞成像，确立了该方法用于活体生物系统疾病机制最小侵入性研究的可行性。与上述纳米线和纳米管内窥镜不同，STABLE作为组织水平成像平台而非细胞内探针运行。

## 3. 光学电极

### 3.1. 集成光学和电化学通道的纤维探针

光学电极不仅作为光导，还作为微/纳米电极同步收集高分辨率和高选择性的电化学和光化学响应。这些探针由三个功能组件构成：作为波导的光纤芯、沉积在光纤表面作为工作电极的导电涂层，以及外层绝缘层。光学纤维电极根据导电层相对于光纤尖端的位置分为三种几何构型：盘电极（导电涂层直接涂覆于纤维远端面）、环电极（导电层环绕尖端附近的侧表面）和侧表面电极（涂层沿纤维侧壁延伸）。每种几何构型涉及光学孔径与电活性表面之间的不同空间关系，这种空间关系决定了光传输和电化学检测能够同时且独立进行的程度。

导电涂层通常为光学不透明的薄膜。这在共享通道设计中造成了光学透明性与电导率之间的直接冲突。该问题在盘电极构型中最为突出，其中导电层沉积于同时作为光学孔径的同一远端面上。

为解决导电表面光传输的局限性，氧化铟锡（ITO）通常被选用，其提供超过80%的可见光透射率，同时维持足够的电导率（电阻率~10^?4 Ω cm），可通过磁控溅射或溶胶-凝胶工艺沉积于光学纤维末端。Pennarun等人引入的微光学环电极（MORE）提供了另一种在探针尖端解耦这两种功能的替代几何构型。MORE采用薄环微电极几何构型，其中商业石英光学纤维（半径125 μm）作为绝缘芯，热沉积~600 nm厚的金层形成导电环。该构型将光直接递送至电化学测量区域，而无金属或半导体层导致的强度衰减，首次实现了吩噻嗪染料亚甲基蓝（MB⁺）短寿命三重态³MB⁺的直接电化学检测。

Smith等人开发的电光混合微探针将微电极和光学纤维整合于单一探针体内，用于同步测量胞外离子通量和胞内荧光信号。在电位计构型中，单模光学纤维（直径125 μm，芯径4 μm，尖端~50 nm）插入钙选择性微电极外壳中并延伸~1 μm超出电极开口；在电流计构型中，激光拉制光学纤维溅射金涂层并以环氧树脂绝缘，形成用于氧检测的薄环微电极。电化学通道以自参考模式运行：探针在两个位置（通常相距10–30 μm）之间以0.1–0.5 Hz振荡，记录扩散梯度内近端和远端位置之间的差分信号，有效消除了静态微电极测量固有的基线漂移和背景噪声。

Spagnolo等人利用金属涂层锥形光学纤维的固有声子特性开发了集成"纤维电极"（Fibertrode）。在锥形波导中，沿传播轴光纤半径的逐渐减小改变了导模的横向波矢，产生相对于锥形轴约24°角的光发射。这种有角度发射将光子从电极表面重定向，该表面距光学窗口仅10 μm，从而消除了对记录位点的直接照明，无需后处理信号校正。在Adora2a-Cre Ai32小鼠纹状体和Thy1-ChR2小鼠体感皮层的体内验证中，实现了无伪迹的光遗传学激活和局部场电位及单单位动作电位的同步细胞外记录。

### 3.2. 通过玻璃纳米毛细管递送光的电化学探针

将纳米毛细管用作光导为制造结合局部辐照和电化学检测的探针提供了优雅解决方案。玻璃壁作为光学波导的原理早在与电化学检测整合之前就在化学传感领域建立。纳米毛细管设计在扫描光电化学显微镜（SPECM）中特别有价值，这需要同步检测光生物质并将光源精确定位相对于被研究表面。

该方法的实际实现在双 barrel 铂微盘电极中得到展示，该电极使用θ纳米毛细管制造并整合到SPECM系统中。探针同时作为局部光源和围绕光系统（PS）I生物阴极的O₂和H₂O₂电化学检测器。毛细管玻璃壳作为光导，通过其供应白光（强度~280 mW/cm²）至探针下方区域。一个Pt盘极化至?600 mV记录扩散限制O₂还原电流，第二个在+600 mV用于安培法H₂O₂氧化。

Yu等人引入的进一步发展用离子电子光电化学方法替代了传统的法拉第电流转换。通过在硼硅酸盐纳米毛细管不对称孔口内限制PbS量子点/PEDOT:PSS光电异质结构建了仿生光驱动离子泵。在470 nm、130 mW cm^?2光照下，PbS量子点内的电荷分离建立了跨孔电位梯度，驱动单向阳离子迁移，在0 V偏压下产生约135 pA的连续光诱导离子电流。该装置在单A549细胞的20个亚细胞位置实现了时空分辨的胞内O₂测量，在线粒体密集和稀疏亚细胞区域对CCCP和寡霉素处理的线粒体呼吸动态监测证实了亚细胞分辨率化疗评估能力。

## 4. 光学和电化学通道分离的组合探针

前述探针设计存在共同约束：当光学和电化学功能分配至同一表面或材料层时，导体选择影响光学透射，反之亦然。不同方法是将每种模态分配至单一探针体内的物理分离通道，使光学波导、电化学电极和递送通道独立运行。这种通道分离允许每个组件独立优化。

一个近期实例是结合光纤芯内光学通道和外表面的IrOx电极的光电生理探针，辅以设计用于阻止激发光到达导电元件从而抑制光电伪迹的全内反射（TIR）层。该工作解决了提高单神经元水平光电生理测量准确性的挑战。使用HT22神经元证明，~1 μm尖端探针比常规锥形纤维更少造成膜损伤，并通过选择尖端直径和单/双通道（473和665 nm）光学输出构型实现细胞内和单神经元光学刺激。

同一作者后续的三合一细胞内纳米探针（TINP）将焦点从抑制伪迹转向扩展纳米电极功能和可靠性。TINP为θ纳米毛细管，外表面形成IrOx涂覆的工作电极，一个内部通道填充Ag/AgCl作为集成自参考电极，第二通道保持空闲用于局部递送。使用大气等离子体射流选择性去除探针尖端Parylene-C绝缘纳米层，精确定义暴露电活性表面的长度，同时保持探针体部绝缘。该制备策略同时满足两个关键要求：为细胞内pH和电位测量提供受控的亚微米操作窗口并最小化膜损伤；以及集成原位自参考和局部递送，提高电动势（EMF）测量准确性并实现单神经元和脑切片水平递送剂诱导的胞内pH瞬态和稳态变化记录。

Canales等人使用热拉伸工艺从聚合物和聚合物-金属复合材料制备多功能神经探针，代表了完全不同的新类别。关键创新在于将三种模态（光遗传学刺激、电生理记录和微流控药物递送）整合至具有与神经组织相当机械性能的单一柔性纤维器件中。作者首次证明了在自由活动小鼠中长期（长达2个月）联合实验的可行性，包括通过嵌入波导的光学刺激、单个神经元活动记录和局部药理学试剂注射。关键成就是显著减少组织反应，免疫组化分析显示与标准金属微丝相比，胶质包裹（GFAP、Iba1、ED1）和血脑屏障破坏（IgG）显著减少。

Lu等人将热拉伸纤维平台扩展至脊髓，以微米级厚度的银纳米线（AgNWs）网格替代导电聚合物复合材料，通过异丙醇溶液浸涂沉积于纤维表面。对于需要更大变形能力的应用，基于环烯烃共聚物弹性体芯的可拉伸变体在高达200%拉伸应变下保持适合细胞外记录的阻抗范围。AgNW网格几何结构相对于连续金属膜的关键优势是其对变形的弹性：三层网格在高达~100%应变下保持低阻抗，这是单层涂层无法实现的。

## 5. 用于扫描探针显微镜的光电电极

扫描探针显微镜的发展推动了将电化学和光学成像整合于单一仪器中的混合方法的出现。目前存在两种主要途径：光通过玻璃纳米毛细管传输并从顶端开口射出；以及通过逐层改性光学纤维形成多功能环探针，或在SICM情况下将光学纤维嵌入玻璃纳米毛细管中。

SICM与近场扫描光学显微镜（SNOM）的首次整合通过改性标准SICM装置实现，使离子电流和散射激光辐射（λ = 532 nm）的光学信号通过外部涂铝的玻璃微毛细管同步记录。该配置实现了活体兔心肌细胞的同步拓扑和近场光学成像。

Lee和Bard开创的扫描电化学显微镜与光学显微镜（SECM/OM）组合基于完全绝缘的金涂层SNOM纤维，在探针顶端形成微米级环电极。Takahashi等人通过SECM和光学显微镜使用锥形光纤和玻璃毛细管电极的方法显著提高了空间分辨率。Maruyama等人开发了基于选择性化学蚀刻GeO₂掺杂光学纤维、随后金溅射和阳极电泳漆电沉积的高度可重复纳米尺度光纤电极制备方法，电极半径从≈100 nm至≈5 nm，成像植入式IDA电极时达到约300 nm的电化学分辨率。

Bae等人报道了首个纳米尺度光电化学扫描探针显微镜（Photo-SECM），探针侧照明。该方法基于玻璃密封金属纳米电极，同时作为电化学传感器和光导，将局部照明光斑投射至基底上。探针侧面照明的关键优势是消除了探针体引起的阴影效应。Askarova等人通过无接触光学递送解决了刚性光学纤维与压电定位器机械耦合引起的振荡问题，使用平凸透镜系统将250 W HgXe灯的光准直并聚焦至探针玻璃毛细管背面。最新的MORE用于SPECM的发展将金涂层光学纤维（~155 μm外径）整合至环氧树脂绝缘的玻璃毛细管中并抛光至平面几何，使探针同时作为光导、光谱探针和电化学传感器运行。

## 6. 结论、挑战与展望

所综述的工作反映了将两种根本不同的细胞询问模式整合至单一微型化探针中的持续努力。光学纳米内窥镜证明了亚细胞结构可以以纳米级空间分辨率和最小膜扰动进行可视化。光电化学探针（共享或分离通道）证明了光递送和电化学检测可以在同一细胞位置共注册。用于神经接口的多功能纤维探针证明了在自由活动动物中同步光遗传学驱动和电生理记录的可行性。基于光纤电极的SPECM平台将光电化学成像扩展至单细胞水平。

贯穿所有探针类别的持续挑战包括：制备可重复性，由于许多混合探针设计所需的手组装步骤引入几何变异性；共享通道架构中光学透明性与电导率之间的基本矛盾，仅部分由ITO和环电极几何解决；分离通道和神经探针设计中探针体与软神经或上皮组织之间的机械不匹配，尽管弹性体纤维拉制和纳米线网格电极取得进展；SPECM探针光学通道空间分辨率仍受金属涂层光泄漏限制，生物学验证模型系统范围仍然狭窄。

这些技术的潜力相当可观。最直接的机遇在于将验证的探针架构扩展至多路分析物检测。大多数当前设计报告单一电化学参数，而驱动该领域的生物学问题经常需要两种或更多分析物的同步测量。第二个更具挑战性的转变是从体外验证到真正体内部署。实现这一目标将需要不仅继续改进单个探针架构，还需要制造材料科学、表面化学和生物学验证之间的更紧密融合。