《Frontiers in Toxicology》：A NAMs-based framework for screening the endocrine-disrupting potential of plastic additives using cross-species molecular docking and Caenorhabditis elegans
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摘要：塑料产量持续增长引发了对可从聚合物基质中浸出的添加剂化学物质的关注，这类物质导致人类和环境广泛暴露。尽管近年来监管机构日益关注内分泌干扰化学品(Endocrine-Disrupting Chemicals, EDCs)及其与塑料添加剂的关联，但大量塑料添
摘要：塑料产量持续增长引发了对可从聚合物基质中浸出的添加剂化学物质的关注，这类物质导致人类和环境广泛暴露。尽管近年来监管机构日益关注内分泌干扰化学品(Endocrine-Disrupting Chemicals, EDCs)及其与塑料添加剂的关联，但大量塑料添加剂的危害信息仍十分有限。本研究应用一种整合新途径方法(New Approach Methodologies, NAMs)的框架，结合计算机(in silico)分子对接与体内秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)试验，高效筛查塑料添加剂的内分泌干扰潜力。研究人员对162种欧盟REACH法规下注册的添加剂分别与人雌激素受体(ERα)和雄激素受体(AR)进行分子对接，随后利用AlphaFold预测的秀丽隐杆线虫核受体(NHR-14和NHR-69)同源模型进行跨物种对接。对跨物种均显示强结合相互作用的化学物质，进一步通过聚焦ER和AR介导效应的系统性文献综述进行评估。通过证据整合，确定1,3-二苯基-1,3-丙二酮(DBM)和2-(苯并三唑-2-基)-4-甲基苯酚(UV-P)为潜在的ER和AR干扰物，随后利用秀丽隐杆线虫野生型N2及功能缺失突变株(nhr-14和nhr-69)进行生殖毒性试验验证了该预测。该整合方法通过将分子相互作用与表型终点相关联，提供了一种实用的基于NAMs的优先排序策略。通过将秀丽隐杆线虫定位为人类毒理学与生态毒理学之间的生物学桥梁，本框架支持"同一健康(One Health)"视角下的跨物种危害表征。
论文解读：基于NAMs跨物种分子对接与秀丽隐杆线虫筛查塑料添加剂内分泌干扰潜力的研究
研究背景与意义
全球塑料生产与消费迅速增长，塑料制品在生产、使用及废弃过程中可释放多种添加剂化学物质至空气、水、土壤及生物体中。许多塑料添加剂（如增塑剂、阻燃剂、抗氧化剂和光稳定剂等）的浸出行为及毒理学特征尚不清楚，其中部分类别被证实可干扰激素信号通路，具有内分泌干扰(Endocrine-Disrupting Chemicals, EDCs)潜力。尽管欧盟CLP法规已将内分泌干扰列为新危险类别，OECD亦提出EDC评估的概念框架(Conceptual Framework)，强调判定内分泌干扰潜力不仅需识别分子起始事件(Molecular Initiating Event, MIE)如受体结合，还需证明其与不良结局(Adverse Outcome, AO)之间存在生物学合理的关联。不良结局路径(Adverse Outcome Pathway, AOP)框架虽可串联MIE至AO，但传统计算机(in silico)分子对接仅能筛查MIE且无法保证关联至AO，而高通量体内验证又依赖脊椎动物试验。秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans，简称C. elegans)约60%–80%基因与人类具可识别直系同源基因，包括核激素受体超家族成员，且具备生命周期短、遗传可操作性强等优势，适合作为连接MIE与AO的非脊椎动物替代模型。因此，研究人员开展此项研究，旨在建立并应用一种整合in silico分子对接与C. elegans体内试验的NAMs框架，筛查塑料添加剂雌激素受体(ERα)和雄激素受体(AR)干扰潜力，并在《Frontiers in Toxicology》发表研究成果，为化学物质优先排序及跨物种危害表征提供实用策略。
主要关键技术方法
研究人员从欧洲化学品管理局(ECHA)塑料添加剂倡议Mapping Exercise中获取417种功能性塑料添加剂名单，排除颜料及不适合分子对接的无机物、高分子、混合物等后保留162种结构合适化合物。人源ERα（PDB: 1GWR agonist，7KBS拮抗剂）和AR（PDB: 2AM9 agonist，1Z95拮抗剂）晶体结构取自PDB并预处理；C. elegans核受体NHR-14（UniProt: O02151）和NHR-69（UniProt: P91829）选取AlphaFold预测全长达结构裁剪配体结合域(Ligand-Binding Domain, LBD)并做骨架限制能量最小化，结合位点由P2Rank v2.5预测。配体3D结构自PubChem获取并用RDKit优化。分子对接采用AutoDock Vina（exhaustiveness=25，30×30×30 ?网格）。对接协议通过共结晶配体重对接（RMSD＜2.0 ?）及已知核受体参比化合物结合亲和力验证。对在人源及线虫同源受体均显示强结合亲和力的候选物进行监管状态调研及PubMed结构化文献检索整合证据排序。体内验证选用C. elegans野生型N2及nhr-14(tm1473)、nhr-69(ok1926)功能缺失突变株，同步化L1幼虫于含测试化合物S-培养基中暴露，进行繁殖力（子代数）测定并以Rose Bengal染色计数，同时测体长区分受体介导效应与全身毒性，数据用R进行统计学分析。
研究结果
3.1 Plastic additive chemical dataset（塑料添加剂化学品数据集）
初始ECHA清单417种物质剔除颜料及结构不适配化合物后保留162种，均为EU REACH下年产量＞100吨 intentional additives，涵盖增塑剂(28.4%)、其他功能(17.3%)、抗氧化剂(14.2%)、阻燃剂(16%)、光稳定剂(7.4%)、热稳定剂(5.6%)、抗静电剂(3.7%)及其他(含成核剂0.6%)。
3.2 Homology modelling of Caenorhabditis elegans receptors（秀丽隐杆线虫受体的同源建模）
AlphaFold预测NHR-14全长平均pLDDT 73.25（LBD 87.44），NHR-69全长平均pLDDT 85.12（LBD 87.29），均超过AlphaFold分子对接常用阈值70。PROCHECK Ramachandran分析显示NHR-14有96.1%残基位于允许区，NHR-69达99.7%；QMEANDisCo评分分别为0.50±0.05和0.59±0.05。P2Rank预测最高得分结合口袋主要位于高置信度区域，表明模型适用于对接筛查。
3.3 Validation of docking protocol（分子对接方案验证）
人源受体共结晶配体重对接RMSD分别为ERα-agonist 1.199 ?、ERα-antagonist 0.590 ?、AR-agonist 0.455 ?、AR-antagonist 0.979 ?，均＜2.0 ?。参比活性化合物（DES、4-OHT、ICI 182,780、BPA、DHT、R1881、羟基氟他胺、乙烯菌核利）结合亲和力均＜?6.0 kcal/mol而非结合参比（莠去津atrazine、邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯DEHP）结合较弱，验证方案具区分能力。
3.4 Molecular docking analysis of plastic additives with human and Caenorhabditis elegans receptors（塑料添加剂对人源及线虫受体的分子对接分析）
162种添加剂四个人源构象及两个线虫受体对接亲和力范围?11.2至?2.8 kcal/mol，中位数ERα ?6.3、AR ?5.5、NHR-14 ?5.9、NHR-69 ?5.6 kcal/mol。按功能类别分析，光稳定剂(n=12)和热稳定剂(n=9)平均结合亲和力最强。取六个受体构象平均结合最强的Top 10化合物进入下一阶段，包括二十八烷二硫醚、氢化三联苯、磷酸三苯酯、UV-P、亚磷酸三苯酯、DBM、1,3-丙二醇-2,2-二甲基-1,3-二苯甲酸酯、UV-531、氧二丙基二苯甲酸酯、氧二亚乙基二苯甲酸酯(DEGDB)。
3.5 Evidence-based prioritization of candidate chemicals（基于证据候选化学物优先排序）
十种候选物中磷酸三苯酯已被SVHC列为ED及美国EPA TSCA优先化学品，氢化三联苯为vPvB-SVHC，其余八种未被所查监管框架列为EDC。文献检索发现DBM报道具ER拮抗（抑制MCF-7细胞E2诱导增殖、下调ER调控癌基因、降低ER–ERE结合）及AR表达抑制活性；UV-P在哺乳动物细胞报告基因试验中显示ERα激动及AR拮抗活性，酵母试验ER为阴性但哺乳细胞阳性。UV-531及DEGDB文献证据有限且无明确ER/AR活性。综合对接与文献证据，选定DBM和UV-P进行体内验证。
3.6 In vivo validation of reproductive toxicity in Caenorhabditis elegans（秀丽隐杆线虫生殖毒性体内验证）
预实验确定DBM 50 μM致死，UV-P 500 μM致完全生殖失败。阳性对照BPA（已知ER激动）在nhr-14突变株500 μM时部分恢复繁殖力，睾酮（AR活性化合物）在nhr-69突变株增强生殖毒性。DBM（1–10 μM）使nhr-14突变株繁殖力略高于N2但未达显著，且10 μM时nhr-14体长显著缩短，提示可能混有全身毒性，NHR-14介导机制尚不确定。UV-P（10–100 μM）致nhr-14及nhr-69突变株繁殖力显著低于N2（50 μM时均显著降低，100 μM时nhr-14进一步抑制），且nhr-69突变株体长无显著变化，排除一般细胞毒性，提示NHR-69可能参与UV-P诱导生殖毒性。
讨论与结论
研究人员指出，该整合方法将对应于OECD概念框架Level 1（in silico非测试方法识别MIE）与Level 3–4（C. elegans整体生物体内分泌相关发育、生殖及行为终点）相结合，通过保守核受体通路连接分子相互作用与表型响应，增强了证据权重并符合OECD强调的分级评估与使用替代方法减少脊椎动物试验之原则。UV-P作为广泛检出但尚未被监管评估ED属性的高产量光稳定剂，凸显了该筛查框架识别监管空白物质之价值。研究也承认局限性：AlphaFold预测结构未考虑配体诱导构象变化，线虫NHR-14/NHR-69并非人ER/AR完全功能等同物，且C. elegans雌雄同体特性使ER与AR通路分离困难，结果应视为筛查级优先排序证据而非终极机制确认。最终结论为：本研究建立了一种整合跨物种分子对接与C. elegans体内试验的NAMs框架，可扩展、机制知情地对塑料添加剂进行内分泌干扰潜力优先排序，符合OECD EDC评估概念框架及3R原则(Replacement, Reduction, Refinement)；以C. elegans作为衔接人类毒理与生态毒理的桥梁模型，推进了One Health视角下的跨物种危害表征。
