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《Toxins》：Qualitative and Quantitative Proteomic Analysis of Venoms from Mexican Rattlesnakes

　　

### 3. 摘要翻译
蛇毒成分是生物学和医学研究的重要领域，但墨西哥毒蛇（尤其是特有种）的毒液研究仍十分有限。本研究采用定量色谱-质谱联用技术（quantitative chromato-mass-spectrometry），对三种墨西哥特有种响尾蛇——Crotalus aquilus、C. triseriatus和C. ravus的毒液进行了蛋白质组学分析，并将结果与北美常见种C. molossus进行了比较。研究在系统发育框架下揭示了这些物种毒液组成的差异。共鉴定出165种蛋白质，分属19个主要蛋白质家族，这与以往蝰蛇科（Viperidae）毒液的研究结果一致。在C. aquilus和C. triseriatus中，最丰富的蛋白质家族为丝氨酸蛋白酶（Serine Proteases, SP）；而在C. triseriatus和C. molossus中，则以蛇毒金属蛋白酶（Snake Venom Metalloproteases, SVMP）为主。无标定量（Label-free quantification, LFQ）结果显示，C. aquilus、C. triseriatus和C. molossus的SVMP含量较高，占毒液总量的28%–47%。相反，C. ravus毒液中47%为磷脂酶A?（Phospholipases A?, PLA?）。在所分析的四个物种中，C. triseriatus与C. aquilus的毒液组成谱最为相似，且二者呈现高度相关性。末端分支和分类群的毒液组成差异更多地由蛋白质丢失而非新蛋白质进化所解释。triseriatus类群共享七种蛋白质，而C. aquilus与C. triseriatus的分支则共享七种衍生蛋白质特征，其中六种为蛋白质丢失。

### 4. 论文主体部分解读

#### 研究背景
蛇伤中毒（snakebite envenoming）被世界卫生组织（WHO）列为发展中国家的公共卫生问题，每年导致约81,000至138,000人死亡及40万例永久性残疾。在美洲大陆，墨西哥因毒蛇咬伤致死人数位居第二，同时拥有全球第二多的毒蛇物种，其中大部分为特有种。然而，大多数墨西哥毒蛇的毒液组成仍属未知。Crotalus属（响尾蛇）和Bothrops属（矛头蝮）的毒液具有肌毒性和神经毒性，可引起局部疼痛、肿胀、低血压、出血、凝血障碍及肌肉损伤等多种临床症状。在Crotalus毒液中，磷脂酶A?（PLA?）、蛇毒金属蛋白酶（SVMP）和丝氨酸蛋白酶（SP）是常见的重要蛋白质家族。墨西哥特有的C. aquilus、C. triseriatus和C. ravus属于triseriatus类群，栖息于墨西哥高原，其中C. ravus因分布于墨西哥城周边人口稠密区，造成了该地区近50%需医疗干预的响尾蛇咬伤。C. aquilus与C. triseriatus曾为同一物种，后被分为姊妹种；C. ravus则在系统发育树上处于triseriatus类群的基部位置，而C. molossus属于durissus类群，与前三者亲缘关系较远。鉴于毒液组成的高度变异性及其对临床救治的影响，研究人员假设C. triseriatus与C. aquilus的毒液组成更为相似，而二者与C. ravus及C. molossus的差异则随系统发育距离增加而增大。

#### 研究开展与结论
本研究旨在定性与定量地解析墨西哥本土三种triseriatus类群响尾蛇（C. aquilus、C. triseriatus、C. ravus）的毒液蛋白质组，并与C. molossus进行比较。研究首次从蛋白质组学角度系统比较了这些物种的毒液成分，揭示了其定量差异及系统发育模式。研究发现，C. molossus的毒液组成最为复杂，C. ravus最为简单，而C. aquilus与C. triseriatus的毒液相似度最高。研究提出，末端分类群的毒液组成差异主要源于蛋白质的丢失而非新蛋白质的获得，这一“末端分类群蛋白质丢失现象”（terminal taxa protein loss phenomenon）为理解毒液演化提供了新视角。此外，研究指出C. ravus毒液中PLA?的高丰度（47.2%）可能与神经毒性相关，而C. aquilus和C. triseriatus则以SP和SVMP为主。该研究发表于《Toxins》，强调了将地方特有毒蛇毒液纳入抗蛇毒血清免疫混合物的必要性，以提升区域救治效果。

#### 关键技术方法
研究人员使用的主要技术方法包括：首先，从墨西哥多个州（包括墨西哥城、墨西哥州、伊达尔戈州、圣路易斯波托西州、瓜纳华托州和萨卡特卡斯州）采集并混合了四个物种的毒液样本（C. aquilus 6条、C. ravus 13条、C. triseriatus 3条、C. molossus 17条），通过SDS-PAGE分离毒液蛋白；随后，将凝胶条带切割后进行胰蛋白酶（trypsin）消化，利用纳米级液相色谱-串联质谱（nano LC-MS/MS）结合Q Exactive HF质谱仪进行蛋白质鉴定，并通过MaxQuant软件及Andromeda搜索引擎进行数据库检索；最后，采用无标定量（Label-free quantification, LFQ）算法对蛋白质进行相对定量，利用Spearman秩相关系数评估物种间蛋白质丰度的相关性，并借助Mezquite软件在Myers等人提供的系统发育树上进行蛋白质特征的ACCTRAN优化分析。

#### 研究结果
**毒液蛋白质谱与鉴定**：通过LC-MS/MS分析，共鉴定出165种蛋白质，分属19个主要蛋白质家族。其中，137种在C. aquilus中检出，136种在C. triseriatus中检出，130种在C. ravus中检出，150种在C. molossus中检出。四个物种共享107种蛋白质，其中SVMP和SP最为普遍。C. aquilus和C. triseriatus中SP含量最高（各占24%），C. ravus和C. molossus中则以SVMP为主（分别占22%和20%）。此外，所有物种均含有PLA?（8%–10%）和C型凝集素（CTL, 6%–8%），而神经生长因子（NGF）、磷脂酶B（PLB）和透明质酸酶（Hya）等含量较低。

**蛋白质相关性分析**：根据LFQ结果，C. ravus毒液中PLA?占比高达47.2%，SVMP占29.6%；C. aquilus的SVMP和SP分别占28.6%和22.8%；C. triseriatus和C. molossus的SVMP分别占45.6%和47.5%。SP虽为丰度最高的蛋白质家族，但在四个物种中的变异范围较大（6.5%–22.8%）。C. aquilus与C. triseriatus的蛋白质强度谱相关性最高（Spearman秩相关系数r_s = 0.89，p = 0.0001），而triseriatus类群三个物种与C. molossus的相关性最低（r_s = 0.38–0.41，p = 0.0001）。

**蛋白质的系统发育分布**：在系统发育树上，四个物种共享107种源于祖先的蛋白质。triseriatus类群演化出四种独特蛋白质（Disintegrin sasaimin、两种Serine endopeptidase及SVMP-CohPH-2），同时共享Cathepsin S-like protein、Filamin-A isoform 9和Venom factor，后三者随后在C. triseriatus中丢失。C. aquilus与C. triseriatus作为姊妹种，共享三种蛋白质（Serine endopeptidase、Serine proteinase 7和Serine proteinase 9），但该分支亦以丢失Alpha-enolase、Lectine beta-CohLL-2、Phospholipase A2 inhibitor 31 kDa subunit-like和Vespryn 1b为特征。C. aquilus仅有一种独特蛋白质（Serine endopeptidase 107）；C. triseriatus有两种（Progesterone-induced-blocking factor 1-like和Thrombin-like enzyme gyroxin B1.4）；C. ravus有两种（Alpha globin和Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase）。值得注意的是，三个物种在各自谱系起源时均发生了大量蛋白质丢失，其中C. ravus丢失最多，包括Acidic phospholipase A?、ATP synthase subunit beta、CRiSP、Ganglioside GM2 activator、LAAO Cdc18、Metalloproteinase及多种Serine endopeptidase等。

#### 讨论总结
讨论部分指出，C. aquilus与C. triseriatus毒液的高度相似性与其姊妹种关系一致，而C. ravus毒液中PLA?的显著富集（47.2%）提示其可能具有较强的神经毒性。研究人员将毒液组成差异与系统发育关系相结合，发现末端分类群的毒液演化主要由蛋白质丢失驱动，而非新蛋白质的产生，这与以往基于毒液编码DNA的研究结果相符。此外，研究还指出，毒液中丰富的生物活性分子具有潜在的药物开发价值，而针对地方特有毒蛇毒液的深入研究将有助于改进抗蛇毒血清的配方。未来需考虑地理、性别和个体发育等因素，开展更精细的毒液变异研究。

研究结论部分指出，本研究首次在定量水平上比较了墨西哥响尾蛇的毒液蛋白质组，共鉴定出165种蛋白质。尽管各物种毒液整体组成相似，但LFQ-MS/MS分析揭示了物种间的定量差异，这些差异可能导致不同的中毒症状和治疗反应。研究人员希望该发现能促进抗蛇毒血清制造商将地方特有毒蛇毒液纳入免疫混合物，以生产更符合区域需求的抗蛇毒血清，并鼓励研究者在系统发育框架下研究毒液分布，基于共享衍生蛋白质而非仅基于总体相似性来开发新型抗蛇毒血清。