铜与PFOS复合暴露通过ROS介导的有丝分裂自噬诱导秀丽隐杆线虫协同神经毒性

《Toxics》：Copper and PFOS Co-Exposure Induces Synergistic Neurotoxicity via ROS-Mediated Mitophagy in C. elegans

　　

摘要：铜(Cu)与全氟辛烷磺酸(perfluorooctanesulfonic acid, PFOS)是普遍共存的环境污染物，单独暴露均可诱导神经毒性，但其复合暴露的联合毒性及交互机制尚不明确，阻碍了对二者复合环境污染健康风险的准确评估。研究人员以秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)为模型，考察了环境相关浓度下Cu与PFOS复合暴露的效应。与单一暴露相比，复合暴露诱发了协同神经毒性，表现为多巴胺能(dopaminergic, DAergic)与谷氨酸能(glutamatergic, GLUergic)神经元丢失、运动缺陷加重、活性氧(reactive oxygen species, ROS)大量蓄积、线粒体膜电位严重下降，并伴有显著的线粒体超微结构损伤及自噬体聚集。机制上，复合暴露诱导的过度氧化应激异常且持续激活了ROS介导的线粒体自噬(mitophagy)通路，损害线粒体质量控制。关键的是，抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)干预可有效缓解复合暴露所致的上述缺陷，证实氧化应激是协同毒性的核心驱动因素。本研究揭示了Cu与PFOS经由氧化应激–线粒体自噬轴产生协同神经毒性的新机制，为完善二者复合污染风险评估提供了关键科学依据。

研究背景与目的

铜(Cu)是重要的微量元素的同时也是日益突出的土壤及水体污染物，中国部分农田土壤及湖泊沉积物中Cu含量已超过国家标准限值，流行病学研究显示生物体内Cu蓄积与阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)及帕金森病(Parkinson's disease, PD)等神经退行性疾病(neurodegenerative diseases, NDDs)密切相关；Cu可通过诱导ROS过量产生、扰乱线粒体代谢及抑制线粒体自噬(mitophagy)损害认知功能。全氟辛烷磺酸(perfluorooctanesulfonic acid, PFOS)是典型的持久性有机污染物，在中国多处水体及工业人群血清中被检出超标，其可在脑内特定区域蓄积，干扰多巴胺与谷氨酸能神经递质系统、改变突触功能及相关蛋白表达，引起线粒体功能障碍、ATP合成下降及ROS爆发，同样涉及PINK1/Parkin介导的线粒体自噬异常。Cu与PFOS因工业排放、电镀、消防泡沫泄漏等在环境中频繁共存，且共享氧化应激与线粒体损伤的神经毒性通路，但二者复合暴露的联合毒性及分子机制尚不清楚。为此，研究人员建立秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans，简称C. elegans)暴露模型，探究Cu–PFOS复合暴露破坏线粒体质量控制网络的机制，为NDDs的环境病因学提供新见解。该论文发表于《Toxics》。

主要关键技术方法

研究人员选用野生型C. elegans N2株及突变株BR4006 [pink-1::GFP]、CF1553 [sod-3::GFP]、DA2123 [lgg-1::GFP]、MAH235 [hlh-30::GFP]（购自Caenorhabditis Genetics Center, CGC），同步化至L1期幼虫后分别暴露于含10 μg/L Cu²⁺、40 ng/L PFOS及二者复合的K-medium中至成虫初期（约48 h）。检测指标及方法包括：以头部摆动(head thrashes)、身体弯曲(body bends)、咽泵频率及排便周期评价运动行为；H₂DCFDA荧光探针检测肠道ROS水平；Tetramethylrhodamine Ethyl Ester(TMRE)染色检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential, MMP)；LysoTracker Green染色标记溶酶体；透射电子显微镜(transmission electron microscopy, TEM)观察线粒体超微结构及自噬体(autophagosome)；qRT-PCR检测抗氧化基因(sod-1, sod-2, sod-3, ctl-1, ctl-2, gst-4)及线粒体自噬相关基因(pink-1, lgg-1, hlh-30)的mRNA相对表达量（2^?ΔΔCT法，actin为内参）；并以1 mM N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)共处理进行抗氧化拯救实验；数据采用单因素方差分析(one-way ANOVA)及Dunnett's检验进行统计学处理。

研究结果

3.1. Effects of Cu and PFOS Co-Exposure on Nervous System and Locomotor Behavior in C. elegans

研究人员通过dat-1::GFP（多巴胺能神经元标记）与eat-4::GFP（谷氨酸能神经元标记）观察发现，Cu或PFOS单独暴露即引起荧光强度降低及部分神经元丢失与突触损伤，复合暴露组上述表型显著加重，多巴胺能与谷氨酸能神经元丢失更明显。运动行为检测显示，单独Cu或PFOS暴露使头部摆动频率分别升高11.33%和2.15%，排便周期分别延长29.58%和30.64%；而复合暴露使头部摆动频率显著降低18.46%，排便周期大幅延长75.96%，身体弯曲与咽泵频率受影响较小。结果表明Cu与PFOS单独暴露造成C. elegans多巴胺能与谷氨酸能神经元损伤及运动缺陷，复合暴露效应更强，提示二者存在协同相互作用。

3.2. Effects of Cu and PFOS Co-Exposure on Oxidative Stress Levels in C. elegans

H₂DCFDA探针检测显示复合暴露组肠道ROS水平显著高于单一暴露组；sod-3::GFP报告株荧光强度在复合暴露组明显增强，反映sod-3表达上调。qRT-PCR结果显示，与对照组相比，复合暴露显著上调抗氧化基因sod-1、sod-2、sod-3、ctl-1、ctl-2及gst-4的mRNA表达（p < 0.05），且高于单一暴露组。以上证实Cu与PFOS复合暴露比单独暴露诱导更强的氧化应激反应，导致抗氧化系统失衡。

3.3. Effects of Cu and PFOS Co-Exposure on Mitochondria Damage in C. elegans

TMRE染色表明，单独Cu或PFOS暴露使MMP显著下降，复合暴露致MMP进一步严重降低，接近阳性对照水平。pink-1::GFP报告株显示Cu、PFOS单独及复合暴露均上调PINK1蛋白表达，复合暴露上调最显著；qRT-PCR也证实pink-1 mRNA表达相应升高。LysoTracker Green染色显示各暴露组溶酶体荧光强度较对照组增强，复合暴露组最强。TEM观察发现，对照组线粒体呈规则椭球状、嵴清晰；单独暴露引起轻度肿胀、膜轻微破损、嵴部分紊乱及少量自噬体；复合暴露则出现广泛线粒体空泡化、明显肿胀、嵴断裂消失、严重结构破坏及大量自噬体堆积。结果表明复合暴露加重线粒体功能损伤与超微结构破坏，并伴随PINK1上调及溶酶体增多。

3.4. Effects of Co-Exposure to Cu and PFOS on Autophagy in C. elegans

利用lgg-1::GFP报告株观察自噬体，Cu或PFOS单独暴露使绿色荧光斑点(puncta)增多，复合暴露组斑点数量及亮度进一步增加，指示自噬体累积。hlh-30::GFP报告株显示单独及复合暴露均促使HLH-30（哺乳动物TFEB转录因子同源物）入核并增强荧光，复合暴露组上调更显著，与溶酶体增多一致。qRT-PCR显示lgg-1与hlh-30 mRNA相对表达量在Cu或PFOS单独暴露时显著上调，复合暴露组上调幅度更大。结果说明复合暴露异常持续激活HLH-30调控的线粒体自噬通路，自噬体生成增加但降解可能受阻。

3.5. NAC Reversed Locomotor Deficits and Neuronal Damage Induced by Cu–PFOS Co-Exposure

研究人员以1 mM NAC共处理复合暴露组，发现eat-4::GFP与dat-1::GFP荧光强度恢复，神经元丢失与突触损伤减轻；头部摆动频率及排便周期回至对照组水平且无统计学差异。证明NAC可缓解Cu–PFOS复合暴露诱导的神经毒性与运动缺陷，支持氧化应激为该协同毒性的上游驱动因素。

3.6. NAC Reverses Oxidative Damage Induced by Co-Exposure to Cu and PFOS

NAC处理使复合暴露升高的ROS水平回落至近对照值，MMP下降被逆转；选取对复合暴露响应最显著的sod-3与gst-4进行qRT-PCR验证，其mRNA表达在NAC处理后显著下调，sod-3恢复至对照组水平。NAC也使pink-1::GFP荧光强度及pink-1 mRNA表达降至近对照水平，证实线粒体膜电位损伤被修复。表明NAC干预有效减轻氧化应激并挽救复合暴露引起的线粒体功能障碍。

3.7. NAC Reverses Mitophagy Disruption Induced by Exposure to Cu and PFOS

NAC处理lgg-1::GFP与hlh-30::GFP报告株后，自噬体斑点数量与荧光强度降低至与对照无差异，LysoTracker荧光显著减弱，lgg-1与hlh-30 mRNA表达明显下调；结合3.6中pink-1表达回降的结果，说明NAC可有效抑制由氧化应激过度驱动的异常线粒体自噬活化，恢复线粒体自噬稳态。

讨论与结论总结

讨论指出，Cu与PFOS在环境中经三元络合等作用共存且相互影响迁移与生物有效性，二者虽化学性质不同但共享氧化应激–线粒体功能障碍–多巴胺能系统损伤的毒性通路；本研究首次证实环境相关浓度下Cu与PFOS复合暴露通过过量ROS异常持续激活PINK1/Parkin介导的线粒体自噬，自噬体积聚且降解受阻、线粒体质量控制失衡，最终导致协同神经毒性，NAC抗氧化干预可逆转该过程，与同类重金属–有机物协同神经毒性研究结论相吻合。

结论部分翻译：

综上所述，环境浓度下Cu与PFOS复合暴露增强了C. elegans体内氧化应激，导致ROS持续蓄积、氧化损伤、线粒体结构损伤及线粒体膜电位降低。PINK1/Parkin介导的线粒体自噬被持续激活，表现为pink-1、hlh-30及lgg-1表达升高。这一过程扰乱了神经元能量代谢与细胞稳态，最终诱发以早发性运动缺陷为特征的神经毒性效应。本研究结果为Cu与PFOS复合暴露的毒性机制提供了新认识，也可为自然环境中重金属与PFOS类污染物复合暴露的风险评估提供参考依据。