通过灵芝生物转化制备新型二氢丹参酮I衍生物及其生物活性评价

《Journal of Fungi》：Preparation and Bioactivity Evaluation of Novel Dihydrotanshinone I Derivatives via Biotransformation by Ganoderma lingzhi

　　

15,16-二氢丹参酮I（DHT）是从丹参中提取的一种重要的亲脂性二萜类化合物，具有显著的药理学潜力，但其治疗应用受到水溶性差的限制。在本研究中，研究人员采用了一种利用灵芝（Ganoderma lingzhi，以其丰富的酶种类而闻名）的微生物生物转化策略，以多样化DHT的化学结构并改善其生物活性特征。通过系统筛选和优化发酵条件，分离并鉴定了七种转化产物。其中，五种被报道为新化合物：17-羟基丹参酮（A）、18,19-二羟基丹参螺缩酮内酯（B-2）、表-18,19-羟基丹参螺缩酮内酯（B-3）、20-羟基丹参酮（C）和19-羟基丹参螺缩酮内酯（D）。生物学评估表明，这些衍生物具有多靶点治疗潜力，包括对4T1和A549癌细胞系的适度细胞毒性作用，以及抗炎和神经保护活性。然而，所有衍生物对六种常见病原体均未观察到显著的抗菌活性。具体而言，化合物A显著抑制了脂多糖（LPS）刺激的RAW 264.7细胞中一氧化氮（NO）的产生，而B-3保护了SH-SY5Y细胞免受H₂O₂诱导的氧化应激。生物转化过程的转录组学分析鉴定了2221个差异表达基因（DEGs），显示在细胞色素P450（CYP450）介导的代谢和氧化应激反应通路中显著富集，并通过定量实时PCR（qPCR）进一步验证。这些结果确立了灵芝（G. lingzhi）作为丹参酮结构修饰的高效生物催化剂，并为药物发现提供了一个新型DHT衍生物库。

丹参（Salvia miltiorrhiza）中的15,16-二氢丹参酮I（DHT）是一种具有抗肿瘤、抗炎和心脏保护等活性的亲脂性二萜类化合物，但其水溶性差、代谢稳定性低，限制了临床应用。传统的化学合成难以处理丹参酮复杂的稠环骨架，存在区域选择性低、反应条件苛刻等问题。微生物生物转化，尤其是利用灵芝（Ganoderma lingzhi）丰富的氧化还原酶系（如细胞色素P450单加氧酶，CYP450s），为结构修饰提供了温和、高选择性的替代途径。然而，灵芝催化DHT转化的潜力尚未被充分探索。为此，研究人员开展本研究，旨在筛选高效菌株，分离鉴定新衍生物，并解析其分子机制。

本研究筛选了五种灵芝属菌株和一种栓菌（Trametes versicolor），通过超高效液相色谱（UPLC）分析选定灵芝（G. lingzhi）作为最佳生物催化剂。优化发酵条件后，进行大规模发酵（8 L培养液，总底物量0.8 g），产物经制备型高效液相色谱（HPLC）和半制备型HPLC分离，通过手性柱拆分得到七个化合物。结构鉴定依赖核磁共振（NMR）、高分辨质谱（HRMS）及电子圆二色光谱（ECD）计算。转录组分析采用de novo测序（MGISEQ-T7平台），鉴定差异表达基因（DEGs）并进行GO/KEGG富集，经qPCR验证。生物活性测试包括细胞增殖抑制（MTT法，细胞系包括A549、4T1等）、抗炎（脂多糖LPS诱导的RAW 264.7细胞NO检测）、神经保护（H₂O₂诱导的SH-SY5Y细胞损伤）和抗菌（微稀释法，六种病原菌）实验。

**3.1 菌株筛选及DHT生物转化条件优化**
通过ULC分析比较六株真菌对DHT的转化能力，发现栓菌和灵芝能完全消耗底物。灵芝因转化率、产物产量高且易于分离而被选为重点。使用二甲基亚砜（DMSO）作为溶剂可增加DHT溶解度并缩短转化时间至3天，底物浓度20 μg/mL时产物产量最高，12天时产物积累达到峰值。

**3.2 生物转化产物的分离与结构鉴定**
经制备HPLC和手性柱分离，获得七个化合物，其中五个为新化合物：17-羟基丹参酮（A，12S,13S,14R构型）、18,19-二羟基丹参螺缩酮内酯（B-2，13S,16S）和表-18,19-羟基丹参螺缩酮内酯（B-3，13R,16S，二者为C-13差向异构体）、20-羟基丹参酮（C，15R）、19-羟基丹参螺缩酮内酯（D，13S,16S）。两个已知化合物为丹参酮（E）和丹参螺缩酮内酯（F）。ECD计算验证了绝对构型。

**3.3 转录组分析及关键生物转化基因鉴定**
对对照组和DHT处理组进行de novo转录组测序，鉴定出2221个DEGs（982个上调，1239个下调）。GO富集表明DEGs主要参与氧化还原过程和氧化还原酶活性。KEGG富集显示“细胞色素P450对外源物代谢”和“药物代谢-细胞色素P450”通路显著激活。qPCR验证了五个关键基因（如4,5-DOPA-双加氧酶DODA、黄烷酮-3-羟化酶F3H、黄酮醇合成酶FLS）的上调，与结构多样化一致。

**3.4 化合物的生物活性**
在20 μM浓度下，所有衍生物对A549细胞有显著抑制活性，化合物A对HCT-8细胞也有抑制作用，但活性浓度偏高。化合物B-2和B-3反而促进某些细胞增殖。化合物A在10 μM时显著抑制LPS诱导的RAW 264.7细胞NO产生（IC₅₀值未明确给出），与阳性对照吲哚美辛相当。化合物B-3在H₂O₂氧化损伤模型中对SH-SY5Y细胞有显著保护作用。所有衍生物在20 μM下对六种病原菌无显著抗菌活性。

讨论部分指出，灵芝对DHT的转化具有高效率和高区域选择性，尤其能目标性羟基化非活化碳原子（如C-17、C-20）。新螺环内酯骨架的形成可能涉及Baeyer-Villiger单加氧酶（BVMOs）介导的氧化裂解和重排。通过逆向合成分析和转录组数据，提出了三条生物转化途径：途径一涉及水解和醛醇加成生成A；途径二通过BVMO扩环生成E和C；途径三通过水解、还原、脱羧和CYP羟基化生成螺环衍生物B-2、B-3和D。结构-活性关系（SAR）提示，C-17羟基化可能增强抗炎活性，螺环骨架有利于神经保护。

结论部分翻译如下：
在本研究中，灵芝被用作微生物生物催化剂，用于15,16-二氢丹参酮I（DHT）的生物转化，分离出七种代谢物，包括五种先前未报道的化合物（A、B-2、B-3、C和D）。这些发现扩展了DHT衍生代谢物的已知结构多样性，并证明了灵芝在温和条件下介导氧化修饰和骨架重排反应的能力。转录组分析表明，多种氧化还原酶相关通路，特别是CYP450相关过程，可能参与DHT的生物转化。几个氧化相关基因的上调为所提出的代谢途径提供了初步的分子证据，但具体的催化酶仍需进一步的实验验证。生物学评估表明，几种转化产物具有选择性生物活性：化合物A在LPS诱导的RAW 264.7细胞中表现出中度抗炎活性，而化合物B-3在SH-SY5Y细胞中显示出对氧化应激的保护作用。然而，在测试条件下未观察到显著的抗菌活性。本研究整合了天然产物化学、转录组学和生物活性筛选，为开发新型先导化合物提供了一个全面的范例。总之，这项工作凸显了药用真菌作为产生结构多样化丹参酮衍生物的有用平台的潜力，并为进一步研究这些代谢物的酶学机制和药理学特性提供了基础。