《Journal of Fungi》：Fungal Communities Associated with Wooden Coffins in a Prehistoric Burial Cave
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研究人员对位于泰国北部夜丰颂府的Phi Man Long Long Rak洞穴（一处距今约2120年的史前墓葬遗址）内木棺相关真菌群落进行了研究。该洞穴以"木棺文化"著称，但木棺已出现显著生物劣化（biodeterioration），推测主要由真菌活动导致。研
研究人员对位于泰国北部夜丰颂府的Phi Man Long Long Rak洞穴（一处距今约2120年的史前墓葬遗址）内木棺相关真菌群落进行了研究。该洞穴以"木棺文化"著称，但木棺已出现显著生物劣化（biodeterioration），推测主要由真菌活动导致。研究采用培养依赖（culture-dependent）与培养非依赖（culture-independent）相结合的方法，旨在表征真菌群落结构、评估其木材降解作用，并识别潜在的环境来源。培养依赖分析从木棺样本中分离出5株曲霉属（Aspergillus）菌株，多数菌株产生纤维素分解酶（cellulolytic enzymes）和半纤维素分解酶（hemicellulolytic enzymes），部分菌株还能产生有机酸，显示出显著的降解潜力。培养非依赖分析揭示群落以曲霉属为优势类群，同时检出培养方法未能检出的青霉属（Penicillium）和Ceriporia等类群，突显了群落多样性及两种方法的互补性。功能预测表明腐生营养型真菌（saprotrophic fungi）占主导。土壤与木棺相关基质间共享优势类群的存在，提示土壤-木棺界面（soil–coffin interface）存在生态连通性，但现有数据无法确定传播方向。所有受试杀菌剂均抑制真菌生长，其中活性组分比例最高的配方效果最佳。这些发现为真菌生物劣化过程提供了见解，并为保护策略的制定提供了依据。
本研究聚焦热带洞穴环境中史前木棺的真菌生物劣化问题，系统整合了环境因子监测、培养依赖与培养非依赖方法、功能预测及杀菌剂敏感性测试，揭示了真菌群落结构、生态功能及潜在来源，并为木文化遗产保护提供了科学依据。
研究背景与问题：洞穴作为重要考古遗址，为理解人类文明发展提供了关键基础。Phi Man Long Long Rak洞穴是泰国北部一处距今约2120年的史前墓葬遗址，以精细制作的木棺为特征，代表了独特的"木棺文化"。然而，这些木棺已遭受严重劣化，面临进一步损坏的风险。木棺劣化由物理、化学和生物因素共同驱动，其中真菌在陆地洞穴环境中因氧气充足而常起主导作用。真菌通过菌丝穿透、木材降解酶及有机酸分泌破坏木材结构。热带洞穴持续高湿和稳定低温的条件极利于真菌定殖。尽管该洞穴保护团队已观察到木棺、棺木相关土壤及人工支撑物表面的真菌生长，但棺木相关真菌是否来源于洞穴内特定环境基质（如土壤、洞壁或其他周围基质）尚不明确。现有研究多依赖培养依赖方法，虽可获得菌株并直接测试其降解能力，但无法揭示完整群落特征；真菌群落在洞穴木文化遗产生物劣化各阶段的功能，尤其是早期劣化启动阶段的功能，以及真菌来源（木材自身或环境库）等问题仍有待阐明。
研究目的：本研究旨在通过整合培养依赖与培养非依赖方法，推进对木棺及洞穴环境中真菌群落结构的理解，重点探究定殖木棺并促成早期生物劣化的真菌群落的生态机制。具体目标包括：鉴定与木棺相关的优势真菌；表征洞穴环境中的真菌群落；评估其生物劣化潜力；确定可能作为棺木相关真菌来源的环境库。
研究结论与意义：稳定的温度（约23°C）和持续的高湿度（约70%）为真菌定殖和代谢活动创造了有利条件，促进了持续的木材劣化。培养依赖分析从木棺样本中分离出曲霉属菌株，具有纤维素分解、半纤维素分解和产酸能力，表明其参与结构多糖降解和早期劣化，但这些分离株仅代表可培养部分。培养非依赖分析鉴定出曲霉属为优势属，尤其在土壤和棺木相关基质中占主导，青霉属、枝孢属（Cladosporium）和Ceriporia也频繁检出。功能预测显示木生腐生真菌占主导。土壤与棺木相关基质之间的组成相似性、共享木材降解类群及木生腐生能力，支持洞穴环境中土壤-木材界面存在生态连通性，但当前数据无法确定真菌传播方向性或主要来源，土壤到木材及木材到土壤的传播途径均可能，表明这些基质之间存在木质纤维素降解真菌的双向交换和生态连通性。所有商用杀菌剂均抑制分离株，混合杀菌剂效果最佳，但实验室抑制效果不一定反映原位性能。研究基于两个四月的有限采样，可能未能完全捕捉洞穴微气候和真菌群落动态的季节性或年际变化。总体而言，这些发现增进了对史前木棺真菌生物劣化过程的理解，为未来功能验证和洞穴遗产环境保护策略提供了基础。
关键技术方法：研究于2023年4月和2024年4月在洞穴A1室开展采样。环境参数监测采用HOBO温度/相对湿度数据记录器以30分钟间隔记录温湿度。样本来源包括：（1）木棺碎片（编号C32的棺盖、棺体及棺标签纸）用于培养依赖分离与生物劣化评估；（2）七组环境基质样本——洞穴土壤（CS，n=3）、棺木土壤（CoS，n=5）、洞穴壁面（CW，n=5）、棺木壁面（CoW，n=6）、棺木壁面可见霉菌（CoM，n=4）、人工支撑物表面（CoSu，n=3）及蝙蝠粪便（BG，n=2），用于培养非依赖分析。真菌分离采用单孢子分离技术，经形态学初步鉴定后，通过ITS、β-微管蛋白（BenA）和钙调蛋白（CaM）序列进行分子鉴定。生物劣化潜力评估包括：以羧甲基纤维素（CMC）、刺槐豆胶、愈创木酚和Tween 20为底物分别检测纤维素酶、甘露聚糖酶、漆酶和脂肪酶活性；通过监测马铃薯葡萄糖肉汤pH变化评估产酸能力。培养非依赖分析采用ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit提取DNA，经ITS1/ITS2引物扩增后进行Illumina MiSeq测序，使用QIIME2（2023.9版）进行生物信息学分析，包括DADA2去噪、UNITE数据库（8.99版）分类学注释；基于Bray-Curtis相似性指数的PERMANOVA检验群落差异；通过FungalTraits进行生态特征功能预测，PICRUSt2预测木材降解酶功能；Venn图分析共享与特有类群。杀菌剂敏感性采用纸片扩散法评估三种商用杀菌剂（以苯扎氯铵、季铵盐化合物和2-辛基-3-异噻唑啉酮为活性组分）在100%、50%、25%和12.5%浓度下的抑菌效果。
研究结果：
环境参数：A1室温度稳定在23°C，相对湿度约70%，处于真菌生长适宜范围。
木棺真菌分离与生物劣化特性：从C32号木棺获得5株纯培养菌株，分别鉴定为土曲霉（A. terreus）、费氏曲霉（A. fischeri）、温特曲霉（A. wentii）、土曲霉和毡状曲霉（A. sclerotiorum）。酶活筛选显示A1、A1-2、A2和A2-2四株菌具有纤维素酶和甘露聚糖酶活性，即纤维素分解和半纤维素分解活性；无漆酶和脂肪酶活性。产酸试验中，A1和A2-3/1两株菌能降低培养基pH至约3.~4.，表明具有产酸能力。这些结果表明分离真菌主要通过酶促降解和酸产生参与木棺生物劣化。
洞穴各位置真菌群落：测序分析共获得10个门、34个纲、92个目、261个科和661个属。子囊菌门（Ascomycota）在六组基质中占60%~90%，担子菌门（Basidiomycota）在洞穴壁面样本中占优（67%）。属水平上，洞穴土壤以青霉属（46%）和曲霉属（41%）为主；棺木土壤中曲霉属（41%）和Botryotrichum（41%）共优；洞穴壁面以Ceriporia（44%）为优势，曲霉属（35%）次之；棺木壁面、棺木壁面霉菌及人工支撑物三类棺木相关基质中曲霉属占绝对主导（69%、81%和86%）。蝙蝠粪便真菌多样性最高，以枝孢属（35%）、曲霉属（20%）、Byssochlamys（18%）、念珠菌属（Candida，17%）等为特征。PERMANOVA分析证实组间群落组成存在显著差异。
Venn图分析：土壤、洞穴壁面、棺木壁面、人工支撑物和蝙蝠粪便五类环境组间，曲霉属、青霉属和Ceriporia为共享类群，存在于所有基质中。Botryotrichum、Byssochlamys和念珠菌属等为部分基质特有。土壤组与棺木等相关基质有显著重叠。
功能预测：FungalTraits分析显示木生腐生型（wood saprotrophs）在所有组中占32%~47%，土壤组最高（47%），洞穴组（45%）和棺木组（42%）次之；分解基质以木材关联真菌最多（31%~46%）。PICRUSt2分析预测20种木材修饰和降解酶，β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）在各环境组中最为丰富，其次为α-葡萄糖苷酶和多种半纤维素降解酶，突显多糖降解潜力。
商用杀菌剂敏感性：所有杀菌剂在100%浓度下对所有分离株产生明显抑制区；含混合活性组分的Brand 3在大多数分离株中抑制效果最佳。50%和25%浓度下仍有效，但抑制区减小。12.5%浓度下效果不稳定，部分分离株无抑制反应。
研究讨论与结论：
环境参数影响：A1室约23°C和70%相对湿度的条件处于真菌生长最优范围，尤其利于木材腐朽真菌。高湿条件促进木材吸湿，为真菌定殖和菌丝穿透创造有利条件。洞穴南部区域存在顶板滴水，该区域木棺真菌定殖最为显著，提示水分对真菌分布的局部促进作用。但采样限于四月，雨季湿度升高可能改变微生物动态。
木棺真菌分离与生物劣化角色：分离的曲霉属种类既往已从木文物和木材相关环境中报道。这些种类产生有机酸和胞外酶，参与木文物劣化。木棺由柚木（Tectona grandis）制成，虽为耐久硬木，但长期暴露仍增加真菌侵染敏感性。分离株的纤维素分解和半纤维素分解活性表明其参与木材初生和次生细胞壁降解，通常与早期劣化相关。半纤维素常是真菌首先攻击分解的主要木材组分，其降解显著削弱木质纤维素结构。未检测到漆酶和脂肪酶活性，但这不排除这些种类在其他条件下产生其他木质素降解酶（如木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶）的可能性。产酸试验中两株菌降低pH至3.~4.，酸性条件可通过酸催化纤维素和半纤维素水解、溶解和软化细胞壁组分、促进空腔和表面裂缝形成，加速结构损伤。然而，培养依赖方法的局限性在于偏好快生长、高产孢种类如曲霉属，可能遗漏特殊环境中不可培养的真菌。
洞穴真菌群落、功能潜力和环境来源：培养非依赖分析揭示曲霉属、青霉属、枝孢属和Ceriporia为优势属。曲霉属、青霉属和Ceriporia在所有环境组共享，提示存在洞穴核心真菌类群。曲霉属和青霉属的高适应性使其在全球洞穴基质中广泛报道，两者均为软腐真菌（soft-rot fungi），能降解纤维素和半纤维素。Ceriporia为白腐真菌（white-rot fungus），具有木质素降解能力。Phlebia的检出可能与木棺和木材碎片的存在有关。Botryotrichum在棺木土壤中的检出暗示棺周土壤有机质富集。木棺多与洞穴地面或土壤直接接触，真菌可在邻近基质间传播。共享真菌类群和曲霉属等土壤-木材共栖种类在土壤和棺木样本中的出现，支持棺木相关真菌来源于周围土壤-棺木环境的可能性。蝙蝠粪便的真菌组成独特，枝孢属和念珠菌属的富集反映蝙蝠作为生物载体引入外部真菌的作用，同时粪便提供营养丰富的有机物促进真菌生长。真菌群落的来源可能包括古老/ native洞穴真菌和外源引入类群，风、渗流水、节肢动物、蝙蝠及人类活动均可成为传播途径。
功能预测进一步支持真菌群落的木材劣化潜能。木生腐生型生活方式的主导反映洞穴真菌对木质纤维素基质的生态适应。酶预测尤其多糖降解酶的支持培养依赖结果，同时预测到培养方法未检出的木质素降解酶和脂肪分解活性，显示更广泛的代谢潜力。但基于ITS数据的功能预测需谨慎解读，因属水平注释限制种水平准确性，且PICRUSt2对真菌ITS数据的适用性受参考基因组数量限制。
真菌控制策略：化学保护方法成为文化遗产材料保护的替代手段。测试的杀菌剂活性成分包括苯扎氯铵、2-辛基-3-异噻唑啉酮和季铵盐化合物。所有杀菌剂体外均抑制真菌生长，含混合活性组分的产品抑制更强，提示相加或协同效应，这有利于减少化学品使用量以降低洞穴环境风险。但体外试验不能完全复现洞穴生态系统的复杂性，若土壤-棺木界面为潜在真菌库，仅处理棺木表面可能无法防止再定殖。这些结果应视为潜在真菌控制策略的初步见解，需进一步评估原位效果、生态影响和长期可持续性。
研究结论部分翻译：本研究调查了泰国北部Phi Man Long Long Rak洞穴（一处2120年历史的史前遗址）古代木棺生物劣化相关真菌群落，整合了环境测定、培养依赖和培养非依赖方法、功能预测及杀菌剂敏感性测试。稳定的温度和持续的湿度为真菌定殖和代谢活动创造了有利条件，促进了持续的木材劣化。培养依赖分析揭示木棺样本中的曲霉属分离株具有纤维素分解、半纤维素分解和产酸能力，表明其参与结构多糖降解和早期劣化。然而，这些分离株仅代表真菌群落的可培养部分。培养非依赖分析鉴定出曲霉属为优势属，尤其在土壤和棺木相关基质中，青霉属、枝孢属和Ceriporia也频繁检出。功能预测显示木生腐生真菌占主导。土壤与棺木相关基质之间的组成相似性，以及共享的木材降解类群和木生腐生能力，支持洞穴环境中土壤-木材界面存在生态连通性。但当前数据无法确定真菌传播方向性或鉴定主要来源，土壤到木材和木材到土壤的传播途径均可能，表明这些基质之间存在木质纤维素降解真菌的双向交换和生态连通性。需要直接溯源研究来确认这些传播途径。所有商用杀菌剂均抑制分离株，混合杀菌剂效果最高；但实验室抑制不一定反映原位性能。本研究基于两个四月采样时段的有限采样，可能未能完全捕捉洞穴微气候和真菌群落动态的季节性或年际变化。总体而言，这些发现增进了对史前木棺真菌生物劣化过程的理解，为未来功能验证和洞穴遗产环境保护策略提供了基础。
